Grundlagen der Biotechnologie at Universität Marburg

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Toxoid-Impfstoff: Definition

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Murine Antikörper: Gewinnung

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Impfstoffe: Qualitätsprüfungen
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Therapeutische Antikörper: Einteilung

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Lebendimpfstoffe: Beispiele

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Homologe polyklonale Immunglobuline: Gewinnung

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Totimpfstoff: Definition
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Chimäre Antikörper: Gewinnung

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Homologe polyklonale Immunglobuline: Verwendung

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Monoklonale Antikörper: Verwendung, Beispiele

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Heterologe polyklonale Antiseren: Gewinnung
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Humane Antikörper: Gewinnung

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Grundlagen der Biotechnologie

Toxoid-Impfstoff: Definition
Toxoid-Impfstoffe sind Subunit-Impfstoffe, die jedoch keine morphologischen Erregerbestandteile enthalten, sondern nur von ihnen produzierte attenuierte Toxine (=Toxoide). Um ihre Immunogenität zu erhöhen werden sie in Form von Adsorbat-Impfstoffen verabreicht, wobei der Impfschutz sich auf das Toxin beschränkt.

Grundlagen der Biotechnologie

Murine Antikörper: Gewinnung
Die Gewinnung muriner Antikörper erfolgt anhand der Hybridom-Technik:

1. Mehrfache Immunisierung einer Maus mit dem gewünschten Antigen
  1. Bildung von spezifischen B-Zellen, die passende Antikörper produzieren

2. Entnahme der Milz und Isolation der B-Zellen
  1. Problem: B-Zellen würden in Kultur nach 14 Tagen absterben

3. Kultivierung von Mäuse-Myelom-Zellen mit Gendefekt für HGPRT (=Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase)

4. Zellfusion der B-Zellen mit Myelom-Zellen führt zu mehreren Produkten
  1. Unfusionierte und fusionierte Plasmazellen: Absterben nach wenigen Tagen
  2. Unfusionierte und fusionierte Myelomzellen: Mangelmutanten sterben im HAT-Medium
  3. Hybridoma-Zellen: Sind unsterblich und überleben im HAT-Medium

5. Trennung der Hybridoma-Zellen durch Auspipettieren
  1. Jedes Aliquot enthält eine Hybridoma-Zelle

6. Klonierung der vorselektonieren Hybridoma-Zellen

7. Identifizierung der AK-produzierenden Hybridoma-Zellen durch Sandwich-ELISA

8. Konservierung der identifizierten Hybridoma-Zellen

8. Charakterisierung der produzierten Antikörper

9. Produktion monoklonaler Antikörper

Merke: Murine Antikörper sind für den Menschen Fremdproteine und stellen selbst Antigene dar! Sie werden daher meist nur diagnostisch eingesetzt.

Grundlagen der Biotechnologie

Impfstoffe: Qualitätsprüfungen
1. Identität

2. Reinheit
  1. Freiheit von pathogenen Erregern
  2. Toxizität am Meerschweinchen
  3. Spezifische Toxizität von Toxoiden
  4. Grenzwertbestimmung von Formaldehyd, Antibiotika und Endotoxinen
  5. Pyrogenfreiheit und Sterilität

3. Gehalt

4. Wirksamkeit im Tierversuch

Grundlagen der Biotechnologie

Therapeutische Antikörper: Einteilung
1. Homologe polyklonale Immunglobuline

2. Heterologe polyklonale Immunseren

3. Monoklonale Antikörper
  1. Murine Antikörper: Konstante und variable Bereiche aus der Maus (-omab)
  2. Chimäre Antikörper: Nur variable Bereiche aus der Maus, konstante Bereiche aus dem Menschen (-ximab)
  3. Humanisierte Antikörper: Nur CDR-Abschnitte aus der Maus, variable und konstante Bereiche aus dem Menschen (-zumab)
  4. Humane Antikörper: Konstante und variable Bereiche aus dem Menschen (-umab)

Grundlagen der Biotechnologie

Lebendimpfstoffe: Beispiele
1. Injektionen
  1. Mumps-Masern-Röteln
  2. Varizellen

2. Schluckimpfungen
  1. Typhus
  2. Rotaviren

Grundlagen der Biotechnologie

Homologe polyklonale Immunglobuline: Gewinnung
Ausgangsmaterial ist gepooltes Plasma aus mindestens 1000 gesunden menschlichen Spendern, die zuvor mehrfach negativ auf HIV, Hepatitis B und C getestet wurden

Reinigung und Konzentration der Immunglobuline (IgG) im Plasma
  1. Fällung von unerwünschten Plasmaeiweißen durch Zugabe von Ethanol
  2. Abtrennung von Plasmafetten und Virushüllproteinen durch Zugabe von Octoxinol (nichtionisches Tensid, welches nicht Proteine denaturiert)
  3. Lagerung bei niedrigem pH-Wert zur Virusinaktivierung
  4. Filtration zur Abtrennung von Viren und IgM
  5. Chromatographische Abtrennung von IgA
  6. Behandlung mit Wasserdampf zur Virusinaktivierung
  7. Nanofiltration zur Abtrennung von Kleinstpartikeln
  8. Abspaltung der Fc-Teile durch Trypsin zu Fab2-Fragmenten (Bessere Verträglichkeit durch geringere Komplementaktivierung)

Reihenfolge und Herstellungsschritte variieren von Hersteller zu Hersteller und von Präparat zu Präparat, jedoch muss jeder Hersteller seinen Prozess mittels beigemischter Modellviren validieren.



Grundlagen der Biotechnologie

Totimpfstoff: Definition
Ein Totimpfstoff ist ein Impfstoff, der bakterielle oder virale attenuierte Krankheitserreger oder Bestandteile enthält, die nicht mehr zur Reproduktion befähigt sind. Dazu zählen Ganzpartikel-Impfstoffe, Spalt-Impfstoffe und Subunit-Impfstoffe.

Grundlagen der Biotechnologie

Chimäre Antikörper: Gewinnung
Ausgangsmaterial zur rekombinanten Herstellung chimärer monoklonaler Antikörper sind die durch Hybridom-Technik gewonnenen Hybridoma-Zellen, welche murine Antikörper produzieren. Chimäre Antikörper bestehen jedoch aus einem murinen Fv- und humanem Fc-Bereich. Das genetische Material beider Bereiche soll am Ende in Form von Plasmiden vorliegen, um eine Wirtszelle die entsprechenden Antikörperfragmente produzieren zu lassen. Dazu muss zunächst die Hybridoma-Zelle gefunden werden, welche den Antikörper mit der höchsten Avidität gegen das gewünschte Antigen produziert, um daraus das genetische Material des Fv-Bereichs zu isolieren. Dies ließe sich praktisch realisieren, indem man ein Gemisch von Antikörpern aller Hybridoma-Zellen kompetetiv an das immobilisierte Antigen binden ließe und anschließend isolieren würde. Problematisch ist dabei aber, dass man nicht mehr nachvollziehen kann, aus welcher Hybridoma-Zelle der entsprechende Antikörper ursprünglich stammt. Die Lösung liegt in der Phagen-Display-Technik und dem Phagen-Panning. Hierbei wird der Antigen-Bindungs-Test mit M13-Phagen durchgeführt, die den Fv-Teil des Antikörpers als Protein auf ihrer Hülle exprimieren und gleichzeitig das genetische Material des Fv-Teils in sich tragen. Die Herstellung so eines Phagens erfolgt anhand der Phagen-Display-Technik, die Ermittlung des Phagens mit der höchsten Avidität anhand des Phagen-Pannings. Wurde der Phage mit der stärksten Bindung einmal gefunden, so kann man aus ihm das genetische Material des Fv-Teils isolieren und in ein Plasmid integrieren, welches den humanen Fc-Teil bereits enthält. Durch Transduktion dieses Plasmids in eukaryotische Wirtszellen wie CHO oder Hybridoma-Zellen produzieren diese nun chimäre monoklonale Antikörper.




Grundlagen der Biotechnologie

Homologe polyklonale Immunglobuline: Verwendung
1. Passive Immunisierung
  1. Prophylaxe der Hepatitis A
  2. Postexpositions-Prophylaxe der Hepatitis B, Masern, Tollwut und FSME
  3. Therapie von Tetanus, Diphterie
  4. Rhesusprophylaxe

2. Substitution bei Immunglobulin-Mangelzuständen

Grundlagen der Biotechnologie

Monoklonale Antikörper: Verwendung, Beispiele
1. Rheumatischen Erkrankungen, Morbus Crohn, Morbus Bechterew und Psoriasis, nachdem Glucokortikoide und Immunsupressiva versagt haben
  1. Infliximab: Chimärer IgG-AK gegen TNF-alpha
  2. Adalimumab: Humaner AK gegen TNF-alpha
  3. Golimumab: Humaner AK gegen TNF-alpha

2. Tumortherapie
  1. Trastuzumab: Humanisierter IgG-AK gegen Her2/neu-Rezeptoren bei Her2/neu-positivem Mammakarzinom in Kombination mit Docetaxel
  2. Rituximab: Chimärer AK gegen CD20 auf B-Zellen bei Leukämie
  3. Bevacizumab: Humanisierter AK gegen VEGF bei Mammakarzinom, Kolonkarzinom, Bronchialkarzinom

3. Allergische Erkrankungen
  1. Omalizumab: Humanisierter IgG-AK gegen IgE bei Bronchialasthma

4.Thrombozytenaggregationshemmung
  1. Abciximab: Chimärer AK gegen GPIIb/IIIa-Rezeptoren auf Thrombozyten bei operativen Eingriffen mit ischämischen Risiko


Grundlagen der Biotechnologie

Heterologe polyklonale Antiseren: Gewinnung
1. Gewinnung des Antigens oder Toxins, gegen das Antikörper gesucht werden
  1. Isolierung, Synthese oder rekombinante Herstellung des Antigen-Proteins

2. Mehrfache Immunisierung von gesunden Tieren wie Kaninchen oder Ziegen mit steigenden Mengen an Antigen
  1. Verringerung des IgM-Gehalts
  2. Erhöhung des IgG-Gehalts

3. Blutentnahme und Aufreinigung zum Antiserum

Grundlagen der Biotechnologie

Humane Antikörper: Gewinnung
Mehrere Möglichkeiten:

1. B- oder Plasmazellen aus Blut, Knochenmark oder Lymphknoten von erkrankten Spendern
  1. Isolierung der mRNA
  2. Umschreibung in cDNA
  3. Amplifizierung des Fv-Bereiches durch PCR
  4. Identifizierung und Charakterisierung der Fv-Bereiche durch Phagen-Display-Technik
  5. Isolierung des Phagens mit der höchsten Avidität durch Phagen-Panning
  6. Integration des humanen Fv-Bereichs in ein Plasmid, das bereits den humanen Fc-Teil enthält
  7. Transduktion des fertigen Plasmids in humane Stammzellen, welche nun humane Antikörper produzieren
  8. Natürliche Paarung des Fv- und Fc-Bereichs gehen verloren

2. Hybridom-Technik mit transgenen Tiere wie der Xeno-, Immuno oder Humab-Maus
  1. Murine Fc- und Fv-Bereiche der Maus wurden gentechnisch durch humane Gene ersetzt
  2. Mehrfache Immunisierung der transgenen Maus mit dem gewünschten Antigen
  3. Isolation von B-Lymphozyten aus der Milz
  4. Fusion mit Myelom-Zellen zu Hybridoma-Zellen
  5. Selektion im HAT-Medium
  6. Trennung der Hybridoma-Zellen durch Auspipettieren
  7. Identifizierung der AK-produzierenden Hybridoma-Zellen durch Sandwich-ELISA
  8. Konservierung der identifizierten Hybridoma-Zellen
  9. Charakterisierung der produzierten Antikörper
  10. Produktion monoklonaler humaner Antikörper


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