Einführung in die Molekularbiologie at Universität Innsbruck

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Exemplary flashcards for Einführung in die Molekularbiologie at the Universität Innsbruck on StudySmarter:

Erläutere im Detail die klassische Methode der DNA-Sequenzierung, für die Frederic Sanger den Nobelpreis
erhalten hat!

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Nachweis eines spezifischen Proteins in einem Gewebe?

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Eine nicht auf Fluoreszenz basierende Methode zur Untersuchung von Protein-DNA Interaktionen
(Materialien, Arbeitsschritte, Visualisierung der Ergebnisse)!

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Vorgehensweise zur Herstellung eines polyklonalen Antikörpers für die molekularbiologische Forschung
(Materialien, Arbeitsschritte, womit arbeitet man später)!?

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Vorgehensweise zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers für die molekularbiologische
Forschung (Materialien

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Ein-Gen-ein Enzym Hypothese: Erklären Sie im Detail die Versuche von Beadle und Tatum aus
dem Jahr 1945, und erläutern Sie, warum mit diesem Ansatz keine nicht-Enzym kodierenden
Gene gefunden werden konnten.

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Erläutern Sie im Detail die Schritte der Translations-Initiation in Eukaryoten!

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Neben den 20 regulären Aminosäuren gibt es noch das Selenocystein, das bei der Translation nur
selten über einen ganz speziellen Mechanismus in ein entstehendes Protein eingebaut wird.
Beschreiben Sie diesen Mechanismus!

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Beschreiben Sie im Detail eine Methode zur Untersuchung der Länge eines Transkripts und definieren
Sie die dafür notwendigen Materialien.

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Erläutern Sie im Detail ein Verfahren zur Untersuchung der zelltypspezifischen Transkription eines
bestimmten Gens (z.B. zur Klärung der Frage ob dieses Gen in bestimmten Neuronen des Rückenmarks
aktiv ist.).

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Erläutern Sie das molekulare Prinzip des Schwangerschaftstest!

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Erläutern Sie im Detail eine nicht auf Fluoreszens basierende Methode zur Untersuchung von Protein-
Protein Interaktion!

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Einführung in die Molekularbiologie

Erläutere im Detail die klassische Methode der DNA-Sequenzierung, für die Frederic Sanger den Nobelpreis
erhalten hat!

Man benötigt: sequenzierende DNA, DNA-Polymerasen, dNTPs, ddNTPs, radioaktive markierter Primer,
Gelelektrophorese
1. DNA-Doppelstrang wir bei 94C denaturiert
2. Hybridisiert mit radioaktivmarkiertem Primem
3. Primer bindet beim Abkühlen auf 50 C
4. Nach dem Abkühlen gebe ich die DNA-Polymerase hinzu + 4 dNTPs (A,G,C,T)
5. Diese Mischung auf 4 Gefäße aufteilen
6. Jeder der Gefäße gebe ich ddNTP hinzu
7. Polymerase fängt mit Synthese an und verlängert den Strang mit dNTPs, bis ein ddNTP kommt, denn dort
fehlt das 3´OH am Zuckergerüst und kann nicht verlängert werden.
8. Abbruch der Synthese
9. Diese unterschiedlich langen Stücke werden mit Gelelektrophorese aufgetrennt. Bei radiomarkierten
Nucleotiden können über Autoradiographie die Banden ausgewertet werden und die DANN-Sequenz
abgelesen werden.

Einführung in die Molekularbiologie

Nachweis eines spezifischen Proteins in einem Gewebe?

Western-Blot:
- Proteingemisch wird entsprechend der Ladung in SDS-Page-Gelektrophorese aufgetrennt.
- Banden auf Membran geblottet, indem man die Membran auf das Gel legt und die Proteine mithilfe von
Strom aus dem Gel treibt.
- Mit Hilfe von Sonden wird das spezifische Protein gesucht:
o Membran wird mit Primärantikörper inkubiert, die am zu suchenden Protein hängen bleiben
o Waschen
o Inkubation mit Sekundärantikörper, die am Primärantikörper binden
o Sekundärantikörper ist mit einem Enzym gekoppelt (Fluoreszenz oder radioaktiv) um es
nachzuweisen.
- Nachweis durch Farbreaktion oder bei Radioaktivität mit dem Röntgenfilm.

Einführung in die Molekularbiologie

Eine nicht auf Fluoreszenz basierende Methode zur Untersuchung von Protein-DNA Interaktionen
(Materialien, Arbeitsschritte, Visualisierung der Ergebnisse)!

EMSA: Gelektrophorese mit
-
-
Ist eine Methode die zum Nachweis von RNA und DNA-bindenden Proteinen z.B.: Transskriptionsfaktoren
Es werden Proteine mit DNA-Fragmente (Sequenz ist bekannt) inkubiert. Bei der DNA-Sequenz handelt es
sich um den regulatorischen Bereich eines Gens.
- Probe wird auf das Agarose-Gel aufgetragen und durch das elektrische Feld werden Komplexe aus DNA
Proteine und ev. Antikörper, nach ihrer Größe nach, aufgetrennt.
- Im Vergleich zu „reinen“ Proteinbanden und DNA-Baden kommt es zu einer Laufzeitverschiebung bei der
Gelelektrophorese:
o DNA-Protein-Antikörper-Komplexe wandern am langsamsten
o DNA-Protein-Komplexe wandern mittelmäßig
o Ungebunden DNA am weitesten
- Die DNA ist radioaktiv markiert, um auf dem Röngtenfilm die Schwarzfärbung zu sehen. Die Färbung, die
weiter oben ist, hat sich mit der DNA verbunden.

Einführung in die Molekularbiologie

Vorgehensweise zur Herstellung eines polyklonalen Antikörpers für die molekularbiologische Forschung
(Materialien, Arbeitsschritte, womit arbeitet man später)!?

Polyklonale Antikörper, sind eine Mischung von Antikörpern, die alle unterschiedliche Epitope eines
Antigens erkennen, also an unterschiedlichen Bereichen des Proteins binden.
1) Gereinigte Proteine/Antigen (Antigen ist ein Protein) wird in einen Organismus injiziert.
2) Organismus stellt gegen das Protein/Antigen Antikörper her. In der Regel nimmt man für eine
polyklonalen Antikörperherstellung ein Antigen, dass von vielen Antikörper an verschiedenen Stellen
erkennt wird.
3) Aus den Tieren, Blut entnehmen und das Serum extrahieren. Das Serum ist das was im Labor
eingesetzt wird. Bevorzugte Tiere: Kaninchen, Ratten, Mäuse, Ziege
4) Bei der ersten Blutserum Entnahme befinden sich nicht so viel Antikörper im Serum. Lösung: Das
Antigen muss mehrmals injiziert werden, durch die Gedächtniszellen vom Immunsystem werden die
Antikörper schneller produziert bzw. mehr produziert. Ausbeute bis zu 90% Antikörper im Serum.

Einführung in die Molekularbiologie

Vorgehensweise zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers für die molekularbiologische
Forschung (Materialien

Monoklonale Antikörper
Diese Seren enthalten nur Antikörper, die alle an ein und dieselbe Stelle am Protein binden.
Wie für die Herstellung von Polyklonalen Antikörpern werden den Tieren durch Injektion des
gewünschten Proteins zuerst immunisiert.
Anschließend werden ihnen aber B-Zellen aus Milz oder Lymphknoten entnommen und diese mit
Krebszellen fusioniert, um ein ungebremstes Wachstum der B-Zellen zu erreichen.
Von diesen B-Zellen werden Zellkulturen angelegt, wobei von jeder ein Antikörper mit einer spezifische
Bindungsstelle produziert wird. Aus den unterschiedlichen Zellkulturen werden nun jene selektiert, die
Antikörper für das gewünschte Epitop erzeugen.

Einführung in die Molekularbiologie

Ein-Gen-ein Enzym Hypothese: Erklären Sie im Detail die Versuche von Beadle und Tatum aus
dem Jahr 1945, und erläutern Sie, warum mit diesem Ansatz keine nicht-Enzym kodierenden
Gene gefunden werden konnten.

• Wildtyp eines haploiden Pilzes wurden durch Röntgenstrahlung mutagenisiert
• Wildtyp und Mutant werden auf Minimalnährböden kultiviert:
Wildtyp: konnte wachsen, da er in der Lage ist alles Aminosäuren selbst herzustellen.
Mutant: konnte nicht wachsen!
• Der Mutant wurde auf Medien gegeben, welche verschiedene Nährstoffe beinhalten,
kultiviert. Ergebnis: Er konnte in den Medien ohne Arginin nicht überleben.
• Fazit: Das Gen, welches für die Bildung von Arginin zuständig war, wurde durch die
Röntgenstrahlung beschädigt. Beschädigtes Gen = keine Bildung des Enzyms, welches die
Bildung von Arginin beeinflusst).
• Ein Gen = ein Enzym!
Heute nicht mehr haltbar, weil Enzyme häufig aus mehreren nichtidentischen
Peptidketten (Peptide) aufgebaut sind. Ein DNA Abschnitt kodiert auch nicht-katalytische

Einführung in die Molekularbiologie

Erläutern Sie im Detail die Schritte der Translations-Initiation in Eukaryoten!

1) Die Translation der mRNA beginnt beim Startcodon AUG, dafür wird eine eigene tRNA
gebraucht.
2) Nur die Initiator Met-tRNA kann zusammen mit verschiedenen eukaryotischen
Initiationsfaktoren (eIFs) an die kleine ribosomale Untereinheit binden – auf der P-Position.
3) Zusammen binden diese dann an den Anfang der mRNA die über die CAP-Struktur an eIF-4E und
eIF-4G gebunden ist.
4) Bewegung des Komplexes entlang der mRNA bis zum ersten AUG unter Hilfestellung von
anderen eIFs (u.a. Helicasen)
5) Ablösen der eIFs und Bindung der großen Untereinheit.
6) Besetzung der A-Position und Anhängen der nächsten Aminosäure
7) Übergang in Elongation

Einführung in die Molekularbiologie

Neben den 20 regulären Aminosäuren gibt es noch das Selenocystein, das bei der Translation nur
selten über einen ganz speziellen Mechanismus in ein entstehendes Protein eingebaut wird.
Beschreiben Sie diesen Mechanismus!

- Selenocystein entsteht enzymatisch aus einem Serin, das an eine besondere tRNA (ACU) gebunden ist.
- Dieses paart mit dem UGA-Codon, einem Codon, das normalerweise den Translationsstopp signalisiert.
Es kommt nicht zum Stopp, da ein zusätzliche loop-Sequenz (Auffaltung) in der Nähe des „Stopp-Codons
UGA“ für eine Interaktion mit Translationsfaktor für eine Recodierung sorgt. Stoppsignal wird somit
ignoriert und mit der Translation wird weitergemacht.

Einführung in die Molekularbiologie

Beschreiben Sie im Detail eine Methode zur Untersuchung der Länge eines Transkripts und definieren
Sie die dafür notwendigen Materialien.

- Northern Blot
- RNA-Probe wird ungeschnitten auf ein denaturierendes Agarosegel aufgetragen. Das Gel wird zuvor mit
Formaldehyd behandelt, damit es die Bildung von Sekundärstrukturen unterbindet.
- Mit Hilfe von Gel-Elektrophorese wird die RNA nach der Größe aufgeteilt.
- RNA wird auf eine Membrane übertragen (Blotten)
- Membran wird in einen Plastiksack mit markierten Sonden „Antisense-Sonden“ gegeben
- Die Banden verbinden sich mit der RNA
- Mit Hilfe von Autoradiographie wir RNA sichtbar gemacht

Einführung in die Molekularbiologie

Erläutern Sie im Detail ein Verfahren zur Untersuchung der zelltypspezifischen Transkription eines
bestimmten Gens (z.B. zur Klärung der Frage ob dieses Gen in bestimmten Neuronen des Rückenmarks
aktiv ist.).

Mit In-situ-Hybridisierung ist es möglich, die Verteilung der verschiedenen RNAs im Gewebe sichtbar zu
machen.
1) RNAs im Gewebe fixieren
2) RNA mit komplementären DNA hybridisieren (markierten antisens Sonden)
„DiG, Flurosezein, P32, S35..“ → Markierungssubstanzen
3) Abwaschen nicht spezifisch gebunden Sonden
Jenach dem welche Markierungssubstanz verwendet wurde, folgend vorgehen:
Für DiG, Fluoreszein oder Biotin markierte Sonden
-
Inkubation mit Enzymgekoppeltem Antikörper
- Abwaschen von nicht spezifisch gebunden Antikörper
- Färbereaktion
- Dokumentation mittels Hellfeldbeleuchtung ode Fluoreszenzmiskroskopie

Einführung in die Molekularbiologie

Erläutern Sie das molekulare Prinzip des Schwangerschaftstest!

hCG-Antigen (Hormon: Humanes Chorion gondotropin) = nur bei Schwangere im Urin!
- Am Anfang des Teststreifens befinden sich freie Antikörper (hCG-Antikörper) die mit einem Farbstoff
markiert wurden.
- Wenn Urin auf den Teststreifen kommt (mit hCG-Antigen) bindet das Antigen an die Antikörper die
eingefärbt wurden.
-
Diese Antigen- Antikörper – Farbstoffkomplex wandert zur Testzone. Dort befindet sich ein zweiter hcG
Antikörper, der durch die immobilierten Antikörper eingefärbt wird. → Schwanger wird dieser Farbig
- Die überschüssig angefärben Antikörper wandern weiter zur Kontrollzone. Wo künstlich hergestellt hCG-
Antigene gebunden sind. Die Antkörper binden wieder an die Antigen → Kontrolle das der Test
funktioniert hat.

Einführung in die Molekularbiologie

Erläutern Sie im Detail eine nicht auf Fluoreszens basierende Methode zur Untersuchung von Protein-
Protein Interaktion!

Co-Immunopräzipition: Die meisten Proteine in der Zelle erfüllen ihre Aufgabe im Verbund mit anderen
Proteine.
-
Es wird ein spezifisches Protein wir aus einem Zelllysat (Lysierten Zelle) mittels eines spezifischen
Antikörpers, der an Perlen gekoppelt ist, ausgefällt (Immunpräzipitation). Ist das Zielprotein im Moment
der Antikörperbindung fest genug an ein anderes Protein gebunden, wird auch das Partnerprotein
ausgefällt und kann durch Massenspektrometrie identifiziert werden.

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