MolBio P at Universität Heidelberg | Flashcards & Summaries

Lernmaterialien für MolBio P an der Universität Heidelberg

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TESTE DEIN WISSEN

Wieso wird dem Lysepuffer noch Proteinkinase K zugegeben?

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--> Proteinkinase K--> baut die meisten Enzyme und Proteine Proetolytisch ab nach Zelllyse 


--> restliche Proteine werden durch organische Lösungsmittel in Phenol/Chloroform-Extraktion entfernt

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Wieso wird der pH vor der PCR oft etwas höher eingestellt als während der PCR nötig?

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Der pKa ist auch temperaturabhängig, sodass bei der Amplifikation ein leicht tieferer pH vorliegt als anfangs eingestellt

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Warum wird IPTG statt Lactose zur Blau-Weiß-Selektion im Nährmedium verwendet?

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Die Lactose ist irgendwann komplett verstoffwechselt. Deswegen wird der künstliche Induktor IPTG verwendet, der auch nach erfolgreicher Spaltung immer noch vorliegt und die Expression des Lac-Operons ermöglicht.

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In welchem Größenbereich [bp] können DNA-Fragmente typischerweise in einerm Agarosegel getrennt werden?
was ist die typische Agarosekonzentration

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0,8 - 2% Agarose
300- 5000bp

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Welche Methode gibt Auskunft über die Größe der isolierten DNA?

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Gelelektrophorese

> kann basen über 20000 nicht mehr trennen

gute Trennung bei 300-5000bp

0,8-2 agarose

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Nenne Sie vier Elemente eines Klonierungsvektors (pBluescript) und ihre Bedeutung.

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1. AmpR: ist ein Selektionsgen und codiert für die Ampicillin Resistenz


2. MCS: Multiple Cloning Site


3. LacZ': ist Teil des Lac-Operons und codiert alpa-UE von beta-Galactosidase --> für Alpha-Komplementation


4. ORI: Origin of Replication markiert den Startpunkt der DNA-Replikation


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Nennen Sie drei Bestandteile des Lysepuffers zur Isolation von menschlicher DNA. Pro
Bestandteil eine Funktion nennen. 2014

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1. SDS: lysiert die Biomembran, denaturiert Proteine zu linearen Polypeptiden


2. EDTA: Koordination/Komplexierung von zweiwertigen Kationen:

--> Ca2+* ist essentiell für die Bindung von Cadherin-Proteinen für die Zell-Zell-Adhäsion, --> Mg2+ ist essentiell für die Bindung der DNAsen an die DNA; diese werden damit inhibiert 


3. Tris/HCl: stellt einen pH von 8 ein: inaktiviert lysosomale Proteine (brauchen saures Milieu) 

deprotoniert das Phosphat-backbone der DNA 


4. H20(nukleasefrei & destilliert)
--> keine Nukleasen;Salze, org. Stoffe usw die Einfluss auf Reaktionnehmen

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qRT-PCR ausgeschrieben?

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quantitative Real time polymerase chain reaction

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Wie ist die Taq-Polymerse aufgebaut und welche Unterschiede gibt es zur E.coli Pol I?

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Die Taq-Polymerase ist 832 AS groß 

 --> intakte 5‘-3‘-Exonuklease-Domäne (entfernt damit „im Weg liegende“ Nukleotide) --> 5‘-3‘-Polymerase-Domäne. 

--> Keine E.coli Pol I über eine funktioinerende 3‘-5‘-Exonuklease-Domäne (keine 3‘-5‘-Exonuklease-Aktivität)  
=kein Proof-reading durchführen.


Sie stammt aus dem gram-negativen Bakterium Thermus aquaticus.

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Wozu benutzt man die Ampicillin Resistenz?

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Die Ampicillin Resistenz kann zur Selektion von transformierten Zellen genutzt werden. Wenn diese zuvor den Vektor mit dem Selektionsgen, dass für eine Resistenz codiert, erhalten und inseriert haben, dann können sie auf einem mit Ampicillin versetzten Medium überleben.

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Warum wird der Lysepuffer zur DNA Isolation aus menschlichen Zellen mit Tris/HCl auf
pH=8 eingestellt? (3 P.) 2013, 2015, 2017

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1.Damit die DNA/Chromosomen deprotoniert vorliegen und in der wässrige/hydrophile Phase ausfallen (obere Phase bei der Phenol-Chloroform-Extraktion) --> Phosphatrückgrat bleibt negativ geladen


2. Milieuoptimum für die Aktivität der Proteinase K, die Proteine/Nukleasen abbaut


3. Hemmt die Aktivität von DNAsen (eigentlich lysosomale Proteine, die ein saures Milieu brauchen) => Von SDS denaturiert


4. EDTA wird deprotoniert, sodass EDTA zweiwertige Kationen wie Mg2+ und Ca2+ komplexiert => DNAsen können nicht an DNA binden und Cadherin-Paare können nicht mehr die Zell-ZellAdhäsion aufrechterhalten

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Wie wirkt Ampicillin?

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Ampicillin ist ein ß-Lactam Antibiotikum. Es hemmt damit die Zellwandsynthese, bzw. die Expression des Proteins D-Alanin-Transpeptidase, dass die Verknüpfung NAM und NAG katalysiert. Damit kann keine funktionelle Mureinschicht aufgebaut werden und die Zelle platzt unter dem osmotischen Druck.

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Q:

Wieso wird dem Lysepuffer noch Proteinkinase K zugegeben?

A:

--> Proteinkinase K--> baut die meisten Enzyme und Proteine Proetolytisch ab nach Zelllyse 


--> restliche Proteine werden durch organische Lösungsmittel in Phenol/Chloroform-Extraktion entfernt

Q:

Wieso wird der pH vor der PCR oft etwas höher eingestellt als während der PCR nötig?

A:

Der pKa ist auch temperaturabhängig, sodass bei der Amplifikation ein leicht tieferer pH vorliegt als anfangs eingestellt

Q:

Warum wird IPTG statt Lactose zur Blau-Weiß-Selektion im Nährmedium verwendet?

A:

Die Lactose ist irgendwann komplett verstoffwechselt. Deswegen wird der künstliche Induktor IPTG verwendet, der auch nach erfolgreicher Spaltung immer noch vorliegt und die Expression des Lac-Operons ermöglicht.

Q:

In welchem Größenbereich [bp] können DNA-Fragmente typischerweise in einerm Agarosegel getrennt werden?
was ist die typische Agarosekonzentration

A:

0,8 - 2% Agarose
300- 5000bp

Q:

Welche Methode gibt Auskunft über die Größe der isolierten DNA?

A:

Gelelektrophorese

> kann basen über 20000 nicht mehr trennen

gute Trennung bei 300-5000bp

0,8-2 agarose

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Q:

Nenne Sie vier Elemente eines Klonierungsvektors (pBluescript) und ihre Bedeutung.

A:

1. AmpR: ist ein Selektionsgen und codiert für die Ampicillin Resistenz


2. MCS: Multiple Cloning Site


3. LacZ': ist Teil des Lac-Operons und codiert alpa-UE von beta-Galactosidase --> für Alpha-Komplementation


4. ORI: Origin of Replication markiert den Startpunkt der DNA-Replikation


Q:

Nennen Sie drei Bestandteile des Lysepuffers zur Isolation von menschlicher DNA. Pro
Bestandteil eine Funktion nennen. 2014

A:

1. SDS: lysiert die Biomembran, denaturiert Proteine zu linearen Polypeptiden


2. EDTA: Koordination/Komplexierung von zweiwertigen Kationen:

--> Ca2+* ist essentiell für die Bindung von Cadherin-Proteinen für die Zell-Zell-Adhäsion, --> Mg2+ ist essentiell für die Bindung der DNAsen an die DNA; diese werden damit inhibiert 


3. Tris/HCl: stellt einen pH von 8 ein: inaktiviert lysosomale Proteine (brauchen saures Milieu) 

deprotoniert das Phosphat-backbone der DNA 


4. H20(nukleasefrei & destilliert)
--> keine Nukleasen;Salze, org. Stoffe usw die Einfluss auf Reaktionnehmen

Q:

qRT-PCR ausgeschrieben?

A:

quantitative Real time polymerase chain reaction

Q:

Wie ist die Taq-Polymerse aufgebaut und welche Unterschiede gibt es zur E.coli Pol I?

A:

Die Taq-Polymerase ist 832 AS groß 

 --> intakte 5‘-3‘-Exonuklease-Domäne (entfernt damit „im Weg liegende“ Nukleotide) --> 5‘-3‘-Polymerase-Domäne. 

--> Keine E.coli Pol I über eine funktioinerende 3‘-5‘-Exonuklease-Domäne (keine 3‘-5‘-Exonuklease-Aktivität)  
=kein Proof-reading durchführen.


Sie stammt aus dem gram-negativen Bakterium Thermus aquaticus.

Q:

Wozu benutzt man die Ampicillin Resistenz?

A:

Die Ampicillin Resistenz kann zur Selektion von transformierten Zellen genutzt werden. Wenn diese zuvor den Vektor mit dem Selektionsgen, dass für eine Resistenz codiert, erhalten und inseriert haben, dann können sie auf einem mit Ampicillin versetzten Medium überleben.

Q:

Warum wird der Lysepuffer zur DNA Isolation aus menschlichen Zellen mit Tris/HCl auf
pH=8 eingestellt? (3 P.) 2013, 2015, 2017

A:

1.Damit die DNA/Chromosomen deprotoniert vorliegen und in der wässrige/hydrophile Phase ausfallen (obere Phase bei der Phenol-Chloroform-Extraktion) --> Phosphatrückgrat bleibt negativ geladen


2. Milieuoptimum für die Aktivität der Proteinase K, die Proteine/Nukleasen abbaut


3. Hemmt die Aktivität von DNAsen (eigentlich lysosomale Proteine, die ein saures Milieu brauchen) => Von SDS denaturiert


4. EDTA wird deprotoniert, sodass EDTA zweiwertige Kationen wie Mg2+ und Ca2+ komplexiert => DNAsen können nicht an DNA binden und Cadherin-Paare können nicht mehr die Zell-ZellAdhäsion aufrechterhalten

Q:

Wie wirkt Ampicillin?

A:

Ampicillin ist ein ß-Lactam Antibiotikum. Es hemmt damit die Zellwandsynthese, bzw. die Expression des Proteins D-Alanin-Transpeptidase, dass die Verknüpfung NAM und NAG katalysiert. Damit kann keine funktionelle Mureinschicht aufgebaut werden und die Zelle platzt unter dem osmotischen Druck.

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