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Lernmaterialien für Biotechnologie und Biokatalyse an der Universität Greifswald

Greife auf kostenlose Karteikarten, Zusammenfassungen, Übungsaufgaben und Altklausuren für deinen Biotechnologie und Biokatalyse Kurs an der Universität Greifswald zu.

TESTE DEIN WISSEN

Was ist eine iterative Sättigungsmutagenese (ISM)? Wie viele Kombinationsmöglichkeiten gibt es bei 5 zu mutierenden Positionen in einem Protein?

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TESTE DEIN WISSEN
  • Erweiterung der einfachen Sättigungsmutagenese
  • durch Analyse der Protein-Struktur oder Homologie-Modelle -> Identifikation von Mutations-hot-spots in Proteinen (betreffen bestimmte Eigenschaft des Proteins) 
  • Durchführung Sättigungsmutagenese an all diesen Stellen in iterativen Zyklen (Schritt für Schritt)
  • Screening der entstandenen Bibliothek auf die gewünschte Eigenschaft 
    1. Nutzen der besten Varianten aus vorherigem Zyklus als Template für nächsten Zyklus 
  • Identifikation Kombinationen von guten Mutationen 
  • Bei 5 Positionen 5!  = 120 ?
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TESTE DEIN WISSEN

Geben Sie ein ausführliches Beispiel für eine erfolgreiche gerichtete Evolution an.

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TESTE DEIN WISSEN
  • Erhöhung der Stabilität einer Peroxidase 
  • Problem: Häm-Peroxidase von Coprinus cinereus (CiP) zeigt unbefriedigende Performance in der Waschmittelanwendung
  • Methoden:
    1. Positions‑gerichtete Mutagenese -> error prone PCR -> DNA-shuffling bei Rekombination in Hefe
    2. Mutanten wurden in S. cerevisiae exprimiert -> beste produziert und von Aspergillus oryzae aufgereinigt 
  • Assay: Messung Peroxidase‑Wert bei pH 10,5 und Erhöhung der H2O2 Konzentration
  • Ergebnis: 
    1. E239 schien wichtig in allen Verbesserungen
    2. Shuffling ergab bestes Ergebnis
    3. (174x Thermostabilität; 100x Oxidations-Stabilität)
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TESTE DEIN WISSEN

Beschreiben Sie eine nicht-rekombinierende Methode.

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TESTE DEIN WISSEN
  • Mutationsstämme:
    1. Defekt in DNA-Reparaturmechanismus -> Mutationen
    2. Plasmid das für Protein codiert wird in solch einen Stamm transformiert (z.B. Epicurian coli XL1-Red) -> Mutationen während der Replikation
    3. Vorteile: einfach, ca 1 Mutation pro 1000 Bp
    4. Nachteil: gesamtes Plasmid/Organismus wird mutiert, nur Punktmutationen, Stamm hält nicht lange
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Erläutern Sie an einem Beispiel eine Selektion (Vor- und Nachteile).

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  • Durchflusszytometrie ( FACS, fluorescence- activated cell sorting)
  • Analyse von Zellen, welche mit hoher Geschwindigkeit einzeln an einer elektrischen Spannung oder einem Lichtstrahl vorbeifließen
  • Selektion von einzelnen Zellen entsprechend ihrer spektroskopischen Eigenschaften
  • bei Fluoreszenzreaktionen oder Kopplung mit Fluoreszenzmarkern. 

+bis zu 10.000 Zellen pro Sekunde (hoher Durchsatz) Auswertung in Echtzeit möglich

+ hohe Spezifität, 

+einfach und preiswert. 

- unerwünschte Nebenreaktionen möglich

-keine Untersuchung von Kinetiken

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TESTE DEIN WISSEN

Erläutern Sie die Strategien um die Produktion/Biosynthese einer bestimmten Zielverbindung zu verbessern

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  • gentechnische Ansätze:
    1. Genmanipulation -> Einklonierung neuer Enzyme in andere Organismen, Mutationen oder Deletionen …
    2. Inhibierung oder Drosselung von Schlüsselenzymen konkurrierender Nebenreaktionen 
    3. Abbau störender/toxischer Intermediate -> vor allem bei neuen Produkten 
    4. Verstärkung der Aktivität oder Überexpression von Schlüsselenzymen des gewünschten Stoffwechselweges 
    5. Etablierung alternativer Stoffwechselwege
    6. Einbau spezifische Enzyme für das gewünschte Substrat
    7. Verhinderung von Produktdegeneration oder Produkthemmung der gewünschten Stoffwechselwege -> Variationen der verantwortlichen Enzyme mit ähnlicher Aktivität
  • Verfahrenstechnische Ansätze:
    1. in vitro Analyse der Metabolite, Substrate und Produktkonzentrationen (z. durch MS‑Analysen)
    2. Anpassung und Variation der Kultivierungsbedingungen zur Erhöhung der Ausbeute
  • Methoden: 
    1. Metagenomics -> Zugang zu Biodiversität (allgemein „omics“‑Technologien -> Stoffflussanalyse)
    2. Ultra-Hochdurchsatz DNA‑Sequenzierung 
    3. Protein-Engineering
    4. Klonierung + Knock out/in
    5. Gensynthese
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Was ist der Unterschied zwischen der scheinbaren und der wahren Enantiomerselektivität?

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  • E(app) -> Messung der Enatiomere getrennt voneinander -> keine Konkurrenz zwischen den beiden (Km wird nicht berücksichtigt)
    • Kmax wird ermittelt
  • E(true) -> Messung der beiden Enatiomere in der Mischung (Racemat) -> Km wird mit einbezogen
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Erläutern sie den Begriff „Metabolic Engineering“. Welches sind die beiden wichtigsten methodischen Ansätzen?

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  • Regulation bzw. Kontrolle des Metabolismus in Zellen um die Konzentration bestimmter Metabolite zu erhöhen
    1. Optimierung der Ausbeute und Produktivität 
    2. Nebenreaktionen verhindern, alternative Stoffwechselwege entwickeln
    3. Verständnis der Organismen, Stoffwechselwege und ihrer Dynamiken von Nöten um Stellen die verändert werden sollen zu identifizieren  -> Verstärkung/Drosslung/Einfügen von Enzymen
  • Zusammenstellung von Reaktionen und deren Abhängigkeit in Netzwerken/Datenbanken
  • Ansätze:
    1. Gentechnischer Ansatz: vorhandene Enzyme anpassen durch biochemische Untersuchungen + Optimierung über rationales/evolutionäres Design
    2. Verfahrenstechnischer Ansatz: Anpassen von Bedingungen oder Verfahren -> Änderung der metabolischen Funktion möglich (Temperatur, pH, Rührgeschwindigkeit…)
    3. synthetisch (bioinformatischer) Ansatz -> Design der Stoffwechselwege anhand von Modellen und Datenbanken -> komplette synthetische Herstellung der Enzyme -> sehr aufwendig
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Beschreiben Sie die Methode der fehlerhaften PCR (error prone PCR). Welche Faktoren werden in der PCR verwendet?

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  • PCR unter Bedingungen, die die natürliche Fehlerrate der DNA-Pol erhöhen (meist Taq-Pol)
  • PCR mit Unterschuss eines Nukleotides (bzw. Variation der Konz. dieser), Mn2+-Addition, Mg2+-Variation
  • Vorteile: einfach, Mutation nur auf gewünschtem Genabschnitt, einstellbare Mutationsrate 
  • Nachteile: Problem bei Ligation, nicht statistischer Austausch der Nukleotide, nur Punktmutationen möglich (Wahrscheinlichkeit, dass AS durch degenerierten genetischen Code ausgetauscht wird ist gering)
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Geben Sie prinzipielle Möglichkeiten zur Durchmusterung von Mutantenbibliotheken an.

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  • Selektion: meist Wachstumssscreening auf Agarplatten (Komplementation) -> nur Mutanten mit vorteilhaften Mutationen überleben
    1. Vorteil: hoher Durchsatz, sehr spezifisch, relativ einfach und preiswert
    2. Nachteil: beschränkt auf Fragestellungen die auf Stoffwechselwegen basieren, unerwünschte Nebenreaktionen/Enzymaktivitäten im Stamm
    3. Beispiel: Phagen-Display
  • Screening:
    1. Wachstum aller Varianten dann screening nach bestimmten Funktionen/Aktivitäten 
    2. meist über Mikrotiterplatten (HTS mit richtigen oder Surrogate-Substraten)
    3. Vorteil: detaillierte und quantitative Analyse möglich, Kinetikbestimmung möglich
    4. Nachteil: meist geringer Probendurchsatz, aufwändigere Analytik
    5. Beispiel: HTS mit GC-MS
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Erläutern Sie den Begriff "gerichtete Evolution".

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  • Evolution im Reagenzglas zur Optimierung/ Modifikation von Proteinen
  • zwei Hauptschritte: 
    1. zufällige Mutagenese von Genen, die Enzyme codieren
    2. Identifikation der gewünschten biokatalytischen Varianten durch Screening oder Selektion
  • wenige Informationen über das Protein nötig (z.B. nichts über Raumstruktur oder Zusammenhänge zwischen Struktur und Mechanismus
  • schnelle Erzeugung zahlreicher Mutationen
  • Nutzen der Bibliothek für viele Fragestellungen (z.B. pH-Stabilität)
  • Voraussetzungen:
    1. Funktionelle Expression in geeignetem Wirt (am besten mikrobiell) 
    2. effektive Mutationsstrategie 
    3. schnelles und zuverlässiges Assaysytem (High Throughput-Screening) -> schnelle Identifikation Enzym-Variante
  • oftmals werden mehrere Durchläufe mit Selektion benötigt (SELEX-Prinzip mit Kreislauf)
  • Methoden rekombinierend und nicht-rekombinierend
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Erklären Sie den Unterschied zwischen rekombinierenden und nicht-rekombinierenden Methoden (sexuelle vs. asexuelle Methoden).

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  • Rekombinierend: DNA-(family)-shuffling, STEP, random priming. ITCHY
    1. Verwendung von Wildtyp-Gen und verwandten Gene -> Vermischung (Rekombination) dieser
  • nicht-rekombinierend: error-prone PCR, Sättigungs-Mutagenese, Kassetten-Mutagenese, Mutations-Stämme
    1. nur Verwendung Wildtyp Gen -> Einführung von Mutationen
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Wie viele Varianten müssen bei der simultanen Sättigungsmutagenese an drei Positionen experimentell durchmustert werden, um 95% der Bibliotheksgröße abzudecken (statt 8000)?


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Beispielhafte Karteikarten für deinen Biotechnologie und Biokatalyse Kurs an der Universität Greifswald - von Kommilitonen auf StudySmarter erstellt!

Q:

Was ist eine iterative Sättigungsmutagenese (ISM)? Wie viele Kombinationsmöglichkeiten gibt es bei 5 zu mutierenden Positionen in einem Protein?

A:
  • Erweiterung der einfachen Sättigungsmutagenese
  • durch Analyse der Protein-Struktur oder Homologie-Modelle -> Identifikation von Mutations-hot-spots in Proteinen (betreffen bestimmte Eigenschaft des Proteins) 
  • Durchführung Sättigungsmutagenese an all diesen Stellen in iterativen Zyklen (Schritt für Schritt)
  • Screening der entstandenen Bibliothek auf die gewünschte Eigenschaft 
    1. Nutzen der besten Varianten aus vorherigem Zyklus als Template für nächsten Zyklus 
  • Identifikation Kombinationen von guten Mutationen 
  • Bei 5 Positionen 5!  = 120 ?
Q:

Geben Sie ein ausführliches Beispiel für eine erfolgreiche gerichtete Evolution an.

A:
  • Erhöhung der Stabilität einer Peroxidase 
  • Problem: Häm-Peroxidase von Coprinus cinereus (CiP) zeigt unbefriedigende Performance in der Waschmittelanwendung
  • Methoden:
    1. Positions‑gerichtete Mutagenese -> error prone PCR -> DNA-shuffling bei Rekombination in Hefe
    2. Mutanten wurden in S. cerevisiae exprimiert -> beste produziert und von Aspergillus oryzae aufgereinigt 
  • Assay: Messung Peroxidase‑Wert bei pH 10,5 und Erhöhung der H2O2 Konzentration
  • Ergebnis: 
    1. E239 schien wichtig in allen Verbesserungen
    2. Shuffling ergab bestes Ergebnis
    3. (174x Thermostabilität; 100x Oxidations-Stabilität)
Q:

Beschreiben Sie eine nicht-rekombinierende Methode.

A:
  • Mutationsstämme:
    1. Defekt in DNA-Reparaturmechanismus -> Mutationen
    2. Plasmid das für Protein codiert wird in solch einen Stamm transformiert (z.B. Epicurian coli XL1-Red) -> Mutationen während der Replikation
    3. Vorteile: einfach, ca 1 Mutation pro 1000 Bp
    4. Nachteil: gesamtes Plasmid/Organismus wird mutiert, nur Punktmutationen, Stamm hält nicht lange
Q:

Erläutern Sie an einem Beispiel eine Selektion (Vor- und Nachteile).

A:
  • Durchflusszytometrie ( FACS, fluorescence- activated cell sorting)
  • Analyse von Zellen, welche mit hoher Geschwindigkeit einzeln an einer elektrischen Spannung oder einem Lichtstrahl vorbeifließen
  • Selektion von einzelnen Zellen entsprechend ihrer spektroskopischen Eigenschaften
  • bei Fluoreszenzreaktionen oder Kopplung mit Fluoreszenzmarkern. 

+bis zu 10.000 Zellen pro Sekunde (hoher Durchsatz) Auswertung in Echtzeit möglich

+ hohe Spezifität, 

+einfach und preiswert. 

- unerwünschte Nebenreaktionen möglich

-keine Untersuchung von Kinetiken

Q:

Erläutern Sie die Strategien um die Produktion/Biosynthese einer bestimmten Zielverbindung zu verbessern

A:
  • gentechnische Ansätze:
    1. Genmanipulation -> Einklonierung neuer Enzyme in andere Organismen, Mutationen oder Deletionen …
    2. Inhibierung oder Drosselung von Schlüsselenzymen konkurrierender Nebenreaktionen 
    3. Abbau störender/toxischer Intermediate -> vor allem bei neuen Produkten 
    4. Verstärkung der Aktivität oder Überexpression von Schlüsselenzymen des gewünschten Stoffwechselweges 
    5. Etablierung alternativer Stoffwechselwege
    6. Einbau spezifische Enzyme für das gewünschte Substrat
    7. Verhinderung von Produktdegeneration oder Produkthemmung der gewünschten Stoffwechselwege -> Variationen der verantwortlichen Enzyme mit ähnlicher Aktivität
  • Verfahrenstechnische Ansätze:
    1. in vitro Analyse der Metabolite, Substrate und Produktkonzentrationen (z. durch MS‑Analysen)
    2. Anpassung und Variation der Kultivierungsbedingungen zur Erhöhung der Ausbeute
  • Methoden: 
    1. Metagenomics -> Zugang zu Biodiversität (allgemein „omics“‑Technologien -> Stoffflussanalyse)
    2. Ultra-Hochdurchsatz DNA‑Sequenzierung 
    3. Protein-Engineering
    4. Klonierung + Knock out/in
    5. Gensynthese
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Q:

Was ist der Unterschied zwischen der scheinbaren und der wahren Enantiomerselektivität?

A:
  • E(app) -> Messung der Enatiomere getrennt voneinander -> keine Konkurrenz zwischen den beiden (Km wird nicht berücksichtigt)
    • Kmax wird ermittelt
  • E(true) -> Messung der beiden Enatiomere in der Mischung (Racemat) -> Km wird mit einbezogen
Q:

Erläutern sie den Begriff „Metabolic Engineering“. Welches sind die beiden wichtigsten methodischen Ansätzen?

A:
  • Regulation bzw. Kontrolle des Metabolismus in Zellen um die Konzentration bestimmter Metabolite zu erhöhen
    1. Optimierung der Ausbeute und Produktivität 
    2. Nebenreaktionen verhindern, alternative Stoffwechselwege entwickeln
    3. Verständnis der Organismen, Stoffwechselwege und ihrer Dynamiken von Nöten um Stellen die verändert werden sollen zu identifizieren  -> Verstärkung/Drosslung/Einfügen von Enzymen
  • Zusammenstellung von Reaktionen und deren Abhängigkeit in Netzwerken/Datenbanken
  • Ansätze:
    1. Gentechnischer Ansatz: vorhandene Enzyme anpassen durch biochemische Untersuchungen + Optimierung über rationales/evolutionäres Design
    2. Verfahrenstechnischer Ansatz: Anpassen von Bedingungen oder Verfahren -> Änderung der metabolischen Funktion möglich (Temperatur, pH, Rührgeschwindigkeit…)
    3. synthetisch (bioinformatischer) Ansatz -> Design der Stoffwechselwege anhand von Modellen und Datenbanken -> komplette synthetische Herstellung der Enzyme -> sehr aufwendig
Q:

Beschreiben Sie die Methode der fehlerhaften PCR (error prone PCR). Welche Faktoren werden in der PCR verwendet?

A:
  • PCR unter Bedingungen, die die natürliche Fehlerrate der DNA-Pol erhöhen (meist Taq-Pol)
  • PCR mit Unterschuss eines Nukleotides (bzw. Variation der Konz. dieser), Mn2+-Addition, Mg2+-Variation
  • Vorteile: einfach, Mutation nur auf gewünschtem Genabschnitt, einstellbare Mutationsrate 
  • Nachteile: Problem bei Ligation, nicht statistischer Austausch der Nukleotide, nur Punktmutationen möglich (Wahrscheinlichkeit, dass AS durch degenerierten genetischen Code ausgetauscht wird ist gering)
Q:

Geben Sie prinzipielle Möglichkeiten zur Durchmusterung von Mutantenbibliotheken an.

A:
  • Selektion: meist Wachstumssscreening auf Agarplatten (Komplementation) -> nur Mutanten mit vorteilhaften Mutationen überleben
    1. Vorteil: hoher Durchsatz, sehr spezifisch, relativ einfach und preiswert
    2. Nachteil: beschränkt auf Fragestellungen die auf Stoffwechselwegen basieren, unerwünschte Nebenreaktionen/Enzymaktivitäten im Stamm
    3. Beispiel: Phagen-Display
  • Screening:
    1. Wachstum aller Varianten dann screening nach bestimmten Funktionen/Aktivitäten 
    2. meist über Mikrotiterplatten (HTS mit richtigen oder Surrogate-Substraten)
    3. Vorteil: detaillierte und quantitative Analyse möglich, Kinetikbestimmung möglich
    4. Nachteil: meist geringer Probendurchsatz, aufwändigere Analytik
    5. Beispiel: HTS mit GC-MS
Q:

Erläutern Sie den Begriff "gerichtete Evolution".

A:
  • Evolution im Reagenzglas zur Optimierung/ Modifikation von Proteinen
  • zwei Hauptschritte: 
    1. zufällige Mutagenese von Genen, die Enzyme codieren
    2. Identifikation der gewünschten biokatalytischen Varianten durch Screening oder Selektion
  • wenige Informationen über das Protein nötig (z.B. nichts über Raumstruktur oder Zusammenhänge zwischen Struktur und Mechanismus
  • schnelle Erzeugung zahlreicher Mutationen
  • Nutzen der Bibliothek für viele Fragestellungen (z.B. pH-Stabilität)
  • Voraussetzungen:
    1. Funktionelle Expression in geeignetem Wirt (am besten mikrobiell) 
    2. effektive Mutationsstrategie 
    3. schnelles und zuverlässiges Assaysytem (High Throughput-Screening) -> schnelle Identifikation Enzym-Variante
  • oftmals werden mehrere Durchläufe mit Selektion benötigt (SELEX-Prinzip mit Kreislauf)
  • Methoden rekombinierend und nicht-rekombinierend
Q:

Erklären Sie den Unterschied zwischen rekombinierenden und nicht-rekombinierenden Methoden (sexuelle vs. asexuelle Methoden).

A:
  • Rekombinierend: DNA-(family)-shuffling, STEP, random priming. ITCHY
    1. Verwendung von Wildtyp-Gen und verwandten Gene -> Vermischung (Rekombination) dieser
  • nicht-rekombinierend: error-prone PCR, Sättigungs-Mutagenese, Kassetten-Mutagenese, Mutations-Stämme
    1. nur Verwendung Wildtyp Gen -> Einführung von Mutationen
Q:


Wie viele Varianten müssen bei der simultanen Sättigungsmutagenese an drei Positionen experimentell durchmustert werden, um 95% der Bibliotheksgröße abzudecken (statt 8000)?


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