Molekularbiologische Übungen EPIGENETIK at Universität für Bodenkultur Wien

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Was ist die Acessionnumber?

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 Aufreinigung eukaryontischer DNA

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Beschreiben Sie die verschiedenen Phasen einer PCR! Was braucht man für einen PCR Ansatz?

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Western-Blot Komponenten:

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Zusätzliche Bande bei Agarosegel Elektrophorese. Warum?

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Wie viel Produkt hat man nach 20 PCR-Runden wenn man mit

a. einem Molekül

b. 10 Molekülen beginnt.

Warum sind diese Werte nicht in der Praxis anzutreffen?

Wieso sinkt Effizienz bei höherer cycle number?

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Ist es sinnvoll mehr als 40 PCR Runden zu machen?

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Sichtbarmachung von Proteinen auf Western Blot

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Warum ist es so wichtig die Effizienz von Referenzgen und Targetgen zu bestimmen? (bei qPCR)

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Wieviele Fragmente entstehen bei einem DNA Fragment, dass mit methylsensitivem Restriktionsenzym geschnitten wird

a. alle drei stellen sind methyliert

b. eine Stelle ist methyliert

c. keine Stelle ist methyliert

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Western Blot Färbemethoden (spezifisch (=immuologisch), unspezifisch)

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Wie heißt der Algorithmus, der verwendet wird um Alignments zu bestimmen und wie die Varianten für DNA/DNA, Protein/Protein, DNA/Protein, Protein/DNA

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Molekularbiologische Übungen EPIGENETIK

Was ist die Acessionnumber?

- Jeder Eintrag in der „GenBank“ seiner Datenbank bekommt eine einzige „accesion number“

- Erlaubt eindeutige Identifizierung für individuelle Datensätze

- Bestehen aus einem Buchsaben und 5 Ziffern neuere Einträge: 2 Buchstaben und 6 Ziffern

- Jeder Sequenzeintrag von GenBank fällt in 2 Kategorien

a) Anmerkung (annotation): Info über Gen/Protein- Definition von Funktion und Genort

b) Sequenz

Molekularbiologische Übungen EPIGENETIK

 Aufreinigung eukaryontischer DNA

1) Zelllyse (mit Puffer → enthält Endoproteasen Proteinkinase K, Degradierung von zellulären Proteinen und SDS denaturiert)

2) Entfernung der RNA durch Verdauung mit Endoribonuklease (RNAse)

3) Entfernung zelluläre Proteine mit e. Salz-Ausfällungsschritt

4) Anreicherung der DNA über Ausfällung mit Isopropanol

5) Ausgefällte DNA wird in einem Puffer aufgelöst

Molekularbiologische Übungen EPIGENETIK

Beschreiben Sie die verschiedenen Phasen einer PCR! Was braucht man für einen PCR Ansatz?

a) Siehe Frage 15

b) - DNA-Lsg

- 2 Primer

- die 4 verschiedenen Desoxynukleotide: dATP, dCTP, dGTP, dTTP

- thermostabile DNA-Polymerase (zB Taq)

- dH2O

-Mg2+

-geeignete Pufferlösungen geeignet für DNA-Pol

Molekularbiologische Übungen EPIGENETIK

Western-Blot Komponenten:

1. SDS-Page-gel

2. Einheit die elektr. Strom generiert

3. Elektrophorese Equipment

4. El. Puffer

5. Protein Transfer Einheit

6. Übertragungspuffer

7. Waschpuffer

8. Blocking Lösung

9. Primary antibody

10. Secondary Antibody (nur benötigt, wenn primary antibody nicht konjugiert ist)

11. Substrat für Enzym zB HRP-Substrat

12. X-Ray Film + Fixierer

13. Und Entwicklungslösung oder „imaging system“

Molekularbiologische Übungen EPIGENETIK

Zusätzliche Bande bei Agarosegel Elektrophorese. Warum?

Elektrophorese“ = Migration von gel. Molekülen in einem def. elektrischen Feld

Wenn Probe nicht ganz rein ist → auch Verunreinigungen → zB kann auch andere

Proteine anzeigen (RNA etc) welche dann, je nach Größe, weiter oder weniger weiter wandern ist abhängig von der Gel-Konzentration und der Feldstärke. DNA ist eig. Immer größer als RNA (bzw andere Proteine) → Banden sind weiter oben am Gel zu sehen (mehr bp) Nach einer PCR erkennt man auch oft eine unscharfe Primer Wolke

Molekularbiologische Übungen EPIGENETIK

Wie viel Produkt hat man nach 20 PCR-Runden wenn man mit

a. einem Molekül

b. 10 Molekülen beginnt.

Warum sind diese Werte nicht in der Praxis anzutreffen?

Wieso sinkt Effizienz bei höherer cycle number?

2^n-2; n= Anzahl der Zyklen

a.) 2^20-2 = 2,6 x 10^5 Kopien

b.)10* 2^20-2 = 2,6 x 10^6 Kopien

 

Parametern die die Effektivität der PCR beeinflussen:

- Beschränkung der Anzahl der DNA-Polymerasemoleküle 

- Halbwertszeit der thermostabilen DNA-Polymerase (zb Halbwertszeit der Taq-Polymerase bei 95°C = 40)

- Beschränkung der Anzahl von dNTPs oder DNA-Oligonukleotiden (Primer) in späteren Phasen der PCR

- Re-Annealing von Produkt-DNA-Einzelsträngen stört das effiziente Anlagern von DNA-Oligonukleotiden (Primern) an entspr. Matrizenstränge

 

Verschiedene Parameter die die Effizienz der qPCR beeinflussen können (Anzahl Zyklen bevor Plateau-Phase eintritt):

je weniger Zyklen notwendig sind, desto mehr Zielmolekül ist in der Probe

Amplifikationseffizienz nimmt durch die Anreicherung des Reaktionsproduktes Pyrophosphat kontinuierlich ab. Wenn Plateau erreicht keine Amplifikation mehr.

Molekularbiologische Übungen EPIGENETIK

Ist es sinnvoll mehr als 40 PCR Runden zu machen?

Nein, da die höchste Effizienz in den ersten wenigen Zyklen der PCR beobachtet

(exponentielle Phase) wird. In den späteren Phasen verläuft die Reaktion mit geringerer

Effizienz und erreicht schließlich die Beschränkungen an der Anzahl der DNAPolymerasemoleküle (d.h weniger als die Anzahl an DNA-Vorlagesträngen)

- Beschränkungen an der Anzahl der DNA-Polymerasemoleküle 

- Halbwertszeit der thermostabilen DNA-Polymerase (Taq-Polymerase bei 95°C = 40min.)

- Beschränkung in der Anzahl von dNTPs oder DNA-Oligonukleotiden (Primer) in

späteren Phasen der PCR

- Re-Annealing von Produkt-DNA-Einzelsträngen stört das effiziente Anlagern von

DNA-Oligonukleotiden (Primern) an ihre entsprechenden Matrizenstränge

Molekularbiologische Übungen EPIGENETIK

Sichtbarmachung von Proteinen auf Western Blot

vorgefärbten Proteinmarkern -> Bestätigung des Transfers auf Membran anschließende Bestimmung der Größe des Zielproteins. 

Proteine, die an Nitrocellulose und PVDF-Membranen gebunden, mit Ponceau S gefärbt werden, bindet an positiv geladenen AS Gruppen der Proteine. Färbung zur Überwachung einer gleichen Beladung und den Transfer der Proteine zu. Die Färbung leicht durch Inkubation in Wasser od. NaOH entfernt werden. Anschließend immunologische Detektion.

Molekularbiologische Übungen EPIGENETIK

Warum ist es so wichtig die Effizienz von Referenzgen und Targetgen zu bestimmen? (bei qPCR)

Annahme: Probe gleicher Menge an Targetgen und Referenzgen, Effizienz des einen Gens=100%, anderes=90% bei 25 Zyklen für die Quantifizierung -> berechneter Fehler bei 3,6 folds oder 360%.

wichtig!: miteinbeziehung der Effizienz des Referenzgens & Targetgens. Mit Hilfe von Standardkurven für die Target- und Referenzgensequenzen oder das LineRegPCT-Programm

Molekularbiologische Übungen EPIGENETIK

Wieviele Fragmente entstehen bei einem DNA Fragment, dass mit methylsensitivem Restriktionsenzym geschnitten wird

a. alle drei stellen sind methyliert

b. eine Stelle ist methyliert

c. keine Stelle ist methyliert

a) 3 von 3 Stellen methyliert → 1 Fragment

b) 1 von 3 Stellen methyliert → 3 Fragmente

c) 0 von 3 Stellen methyliert → 4 Fragmente


Molekularbiologische Übungen EPIGENETIK

Western Blot Färbemethoden (spezifisch (=immuologisch), unspezifisch)

???

Molekularbiologische Übungen EPIGENETIK

Wie heißt der Algorithmus, der verwendet wird um Alignments zu bestimmen und wie die Varianten für DNA/DNA, Protein/Protein, DNA/Protein, Protein/DNA

BLAST = Basic Local Alignment Search Tool, basiert auf FASTA Algorithmus.

1) blastn: DNA/DNA

2) blastx: Protein/Protein

3) blastp: DNA/ Protein

4) tblastn: Protein/DNA

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