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Karteikarten
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Studierende
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Lernmaterialien
Beschreiben Sie die verschiedenen Phasen einer PCR! Was braucht man für einen PCR Ansatz?
a) Siehe Frage 15
b) - DNA-Lsg
- 2 Primer
- die 4 verschiedenen Desoxynukleotide: dATP, dCTP, dGTP, dTTP
- thermostabile DNA-Polymerase (zB Taq)
- dH2O
-Mg2+
-geeignete Pufferlösungen geeignet für DNA-Pol
Aufreinigung eukaryontischer DNA
1) Zelllyse (mit Puffer → enthält Endoproteasen Proteinkinase K, Degradierung von zellulären Proteinen und SDS denaturiert)
2) Entfernung der RNA durch Verdauung mit Endoribonuklease (RNAse)
3) Entfernung zelluläre Proteine mit e. Salz-Ausfällungsschritt
4) Anreicherung der DNA über Ausfällung mit Isopropanol
5) Ausgefällte DNA wird in einem Puffer aufgelöst
Sichtbarmachung von Proteinen auf Western Blot
vorgefärbten Proteinmarkern -> Bestätigung des Transfers auf Membran anschließende Bestimmung der Größe des Zielproteins.
Proteine, die an Nitrocellulose und PVDF-Membranen gebunden, mit Ponceau S gefärbt werden, bindet an positiv geladenen AS Gruppen der Proteine. Färbung zur Überwachung einer gleichen Beladung und den Transfer der Proteine zu. Die Färbung leicht durch Inkubation in Wasser od. NaOH entfernt werden. Anschließend immunologische Detektion.
Welche Funktion hat ein Kalibrator bei qPCR und auch das Referenzgen beschreiben
Kalibrator = Eine einzelne Referenzprobe verwendet als Grundlage für den relativen Anstieg der Expressionsstudie (Annahme: konstanten Reaktionseffizienz). Dient zur Berechnung der Anzahl der kopierten Gene.
Bestimmung der Genkopieanzahl: Kalibrationsprobe mit bekannten Kopieanzahl (Referenz) wird mit Probe (Ziel) mit unbekannten Kopieanzahl verglichen. Amplifikationsseffizienz der beiden muss sehr ähnlich sein.
Referenzgen = Gene, die weit verbreitet sind, Annahme: konstanten Expression, werden als Referenzgene für die Normierung in qPCR verwendet.
Wie macht man eine positiv bzw. negativ Kontrolle beim PCR?
+ Kontrolle : zeigt prinzipielle funktionsweise der Reaktion an, zB bekannter DNA
Abschnitt um sicher zu gehen ob die Reaktion wirklich funktioniert hat
- Kontrolle: (meist ohne Zugabe von DNA) : zeigt Kontamination an, oft dH2O
E-Value/Wert bei BLAST-Analyse beschreiben
Expecting Value E: basiert auf der Größe der analysierten Sequenz und auf der
Summe der Größen aller im Sequenzvergleich verwendeten Sequenzen.
E = mn / 2^(-S`)
Je kleiner der resultierende E-Wert, desto unwahrscheinlicher ist das Auftreten einer zufälligen Angleichung. E-Werte > 0,001 (dh. 1 e^-3) werden als statistisch nicht signifikant betrachtet.
Denkbeispiel: Sequenz (5'-CmCGG-3') mit Bisulfit behandelt und anschließend
mit PCR vervielfacht. Anschließend noch mit Restriktionsenzymen schneidbar die
5'-CCGG-3' erkennen?
Nein. 5'-CmCGG-3' wird nach Bisulfit-Behandlung zu 5'-CmUGG-3'. Dies kann das
Restriktionsenzym nicht mehr erkennen.
Ist es sinnvoll mehr als 40 PCR Runden zu machen?
Nein, da die höchste Effizienz in den ersten wenigen Zyklen der PCR beobachtet
(exponentielle Phase) wird. In den späteren Phasen verläuft die Reaktion mit geringerer
Effizienz und erreicht schließlich die Beschränkungen an der Anzahl der DNAPolymerasemoleküle (d.h weniger als die Anzahl an DNA-Vorlagesträngen)
- Beschränkungen an der Anzahl der DNA-Polymerasemoleküle
- Halbwertszeit der thermostabilen DNA-Polymerase (Taq-Polymerase bei 95°C = 40min.)
- Beschränkung in der Anzahl von dNTPs oder DNA-Oligonukleotiden (Primer) in
späteren Phasen der PCR
- Re-Annealing von Produkt-DNA-Einzelsträngen stört das effiziente Anlagern von
DNA-Oligonukleotiden (Primern) an ihre entsprechenden Matrizenstränge
qPCR 3 Detektionsmethoden angeben/erklären
a.) sequenzspezifisch: basierend auf FRET
-Hydrolisierungsproben (Taqman)
-Hybridisierungsproben (molecular beacon, LUX primers)
ein Mechanismus, bei dem Energie zw 2 lichtsensitiven Chromophoren transferiert wird. Geamte freigesetzte Anregungsenergie des Reporters wird vom Quencher gefangen. Quencher wird ducrh zb Taq-Polymerase entfernt, Reporter freigegeben
Hybridisierungsproben (DNA Fragment markiert) transferieren die Energie zu 2. Chromophor, welches langwelligeres Licht freilässt als die anregende Wellenlänge und die Emission von der ersten Probe
b.) nicht sequenzspezifisch
Verwendung von Floureszenzfarbstoffen, die sich in die DNA Doppelhelix einlagern zb. SYBR-Green
Vorteil: Ziel-Spezifikation, präzise&sensitiv
Nachteil: teuer
Western-Blot Komponenten:
1. SDS-Page-gel
2. Einheit die elektr. Strom generiert
3. Elektrophorese Equipment
4. El. Puffer
5. Protein Transfer Einheit
6. Übertragungspuffer
7. Waschpuffer
8. Blocking Lösung
9. Primary antibody
10. Secondary Antibody (nur benötigt, wenn primary antibody nicht konjugiert ist)
11. Substrat für Enzym zB HRP-Substrat
12. X-Ray Film + Fixierer
13. Und Entwicklungslösung oder „imaging system“
Wofür wird RNAse verwendet bei der gDNA Reinigung + generell gDNAReinigung.
4-Schritte Prozess.
1. Zelle lysiert.Puffer aus SDS und Proteinkinase K. zelluläre Proteine werden abgebaut.
2. Zelllysate mit RNase verdaut, um RNA zu entfernen (darf keine DNase enthalten).
3. zelluläre Proteine mit konz. NaCl gefällt und per Zentrifugation entfernt. Im
4. wird die genomische DNA mit Isopropanol gefällt.
5. wird sie erneut in einem Puffer gelöst.
Verwendung Calibrator PCR
Bestimmung der Genkopienummer:
Eine Kalibrierprobe wird mit einer bekannten Kopienzahl (Referenzzahl) mit einer
Probe (Ziel) mit einer unbekannten Kopienzahl verglichen.
➔ Methode funktioniert nur, wenn die Amplikationseffizienzen sehr ähnlich sind
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