Molekularbiologische UE Epigenetik at Universität Für Bodenkultur Wien | Flashcards & Summaries

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Lernmaterialien für Molekularbiologische UE Epigenetik an der Universität für Bodenkultur Wien

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TESTE DEIN WISSEN

Beschreiben Sie die verschiedenen Phasen einer PCR! Was braucht man für einen PCR Ansatz?

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TESTE DEIN WISSEN

a) Siehe Frage 15

b) - DNA-Lsg

- 2 Primer

- die 4 verschiedenen Desoxynukleotide: dATP, dCTP, dGTP, dTTP

- thermostabile DNA-Polymerase (zB Taq)

- dH2O

-Mg2+

-geeignete Pufferlösungen geeignet für DNA-Pol

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TESTE DEIN WISSEN

 Aufreinigung eukaryontischer DNA

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TESTE DEIN WISSEN

1) Zelllyse (mit Puffer → enthält Endoproteasen Proteinkinase K, Degradierung von zellulären Proteinen und SDS denaturiert)

2) Entfernung der RNA durch Verdauung mit Endoribonuklease (RNAse)

3) Entfernung zelluläre Proteine mit e. Salz-Ausfällungsschritt

4) Anreicherung der DNA über Ausfällung mit Isopropanol

5) Ausgefällte DNA wird in einem Puffer aufgelöst

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TESTE DEIN WISSEN

Sichtbarmachung von Proteinen auf Western Blot

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TESTE DEIN WISSEN

vorgefärbten Proteinmarkern -> Bestätigung des Transfers auf Membran anschließende Bestimmung der Größe des Zielproteins. 

Proteine, die an Nitrocellulose und PVDF-Membranen gebunden, mit Ponceau S gefärbt werden, bindet an positiv geladenen AS Gruppen der Proteine. Färbung zur Überwachung einer gleichen Beladung und den Transfer der Proteine zu. Die Färbung leicht durch Inkubation in Wasser od. NaOH entfernt werden. Anschließend immunologische Detektion.

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TESTE DEIN WISSEN

Welche Funktion hat ein Kalibrator bei qPCR und auch das Referenzgen beschreiben

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TESTE DEIN WISSEN

Kalibrator = Eine einzelne Referenzprobe verwendet als Grundlage für den relativen Anstieg der Expressionsstudie (Annahme: konstanten Reaktionseffizienz). Dient zur Berechnung der Anzahl der kopierten Gene. 

Bestimmung der Genkopieanzahl: Kalibrationsprobe mit bekannten Kopieanzahl (Referenz) wird mit Probe (Ziel) mit unbekannten Kopieanzahl verglichen. Amplifikationsseffizienz der beiden muss sehr ähnlich sein. 

Referenzgen = Gene, die weit verbreitet sind, Annahme: konstanten Expression, werden als Referenzgene für die Normierung in qPCR verwendet.

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TESTE DEIN WISSEN

Wie macht man eine positiv bzw. negativ Kontrolle beim PCR?

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TESTE DEIN WISSEN

+ Kontrolle : zeigt prinzipielle funktionsweise der Reaktion an, zB bekannter DNA

Abschnitt um sicher zu gehen ob die Reaktion wirklich funktioniert hat

- Kontrolle: (meist ohne Zugabe von DNA) : zeigt Kontamination an, oft dH2O

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TESTE DEIN WISSEN

E-Value/Wert bei BLAST-Analyse beschreiben

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TESTE DEIN WISSEN

Expecting Value E: basiert auf der Größe der analysierten Sequenz und auf der

Summe der Größen aller im Sequenzvergleich verwendeten Sequenzen.

E = mn / 2^(-S`)

Je kleiner der resultierende E-Wert, desto unwahrscheinlicher ist das Auftreten einer zufälligen Angleichung. E-Werte > 0,001 (dh. 1 e^-3) werden als statistisch nicht signifikant betrachtet.

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TESTE DEIN WISSEN

Denkbeispiel: Sequenz (5'-CmCGG-3') mit Bisulfit behandelt und anschließend

mit PCR vervielfacht. Anschließend noch mit Restriktionsenzymen schneidbar die 

5'-CCGG-3' erkennen?

Lösung anzeigen
TESTE DEIN WISSEN

Nein. 5'-CmCGG-3' wird nach Bisulfit-Behandlung zu 5'-CmUGG-3'. Dies kann das

Restriktionsenzym nicht mehr erkennen.

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TESTE DEIN WISSEN

Ist es sinnvoll mehr als 40 PCR Runden zu machen?

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TESTE DEIN WISSEN

Nein, da die höchste Effizienz in den ersten wenigen Zyklen der PCR beobachtet

(exponentielle Phase) wird. In den späteren Phasen verläuft die Reaktion mit geringerer

Effizienz und erreicht schließlich die Beschränkungen an der Anzahl der DNAPolymerasemoleküle (d.h weniger als die Anzahl an DNA-Vorlagesträngen)

- Beschränkungen an der Anzahl der DNA-Polymerasemoleküle 

- Halbwertszeit der thermostabilen DNA-Polymerase (Taq-Polymerase bei 95°C = 40min.)

- Beschränkung in der Anzahl von dNTPs oder DNA-Oligonukleotiden (Primer) in

späteren Phasen der PCR

- Re-Annealing von Produkt-DNA-Einzelsträngen stört das effiziente Anlagern von

DNA-Oligonukleotiden (Primern) an ihre entsprechenden Matrizenstränge

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TESTE DEIN WISSEN

qPCR 3 Detektionsmethoden angeben/erklären

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TESTE DEIN WISSEN

a.) sequenzspezifisch: basierend auf FRET

-Hydrolisierungsproben (Taqman)

-Hybridisierungsproben (molecular beacon, LUX primers)

ein Mechanismus, bei dem Energie zw 2 lichtsensitiven Chromophoren transferiert wird. Geamte freigesetzte Anregungsenergie des Reporters wird vom Quencher gefangen. Quencher wird ducrh zb Taq-Polymerase entfernt, Reporter freigegeben

Hybridisierungsproben (DNA Fragment markiert) transferieren die Energie zu 2. Chromophor, welches langwelligeres Licht freilässt als die anregende Wellenlänge und die Emission   von der ersten Probe

b.) nicht sequenzspezifisch

Verwendung von Floureszenzfarbstoffen, die sich in die DNA Doppelhelix einlagern zb. SYBR-Green 

Vorteil: Ziel-Spezifikation, präzise&sensitiv

Nachteil: teuer

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TESTE DEIN WISSEN

Western-Blot Komponenten:

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TESTE DEIN WISSEN

1. SDS-Page-gel

2. Einheit die elektr. Strom generiert

3. Elektrophorese Equipment

4. El. Puffer

5. Protein Transfer Einheit

6. Übertragungspuffer

7. Waschpuffer

8. Blocking Lösung

9. Primary antibody

10. Secondary Antibody (nur benötigt, wenn primary antibody nicht konjugiert ist)

11. Substrat für Enzym zB HRP-Substrat

12. X-Ray Film + Fixierer

13. Und Entwicklungslösung oder „imaging system“

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TESTE DEIN WISSEN

Wofür wird RNAse verwendet bei der gDNA Reinigung + generell gDNAReinigung.

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TESTE DEIN WISSEN

4-Schritte Prozess. 

1. Zelle lysiert.Puffer aus SDS und Proteinkinase K. zelluläre Proteine werden abgebaut. 

2. Zelllysate mit RNase verdaut, um RNA zu entfernen (darf keine DNase enthalten). 

3. zelluläre Proteine mit konz. NaCl gefällt und per Zentrifugation entfernt. Im 

4. wird die genomische DNA mit Isopropanol gefällt.

5. wird sie erneut in einem Puffer gelöst.

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TESTE DEIN WISSEN

Verwendung Calibrator PCR

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TESTE DEIN WISSEN

Bestimmung der Genkopienummer:

Eine Kalibrierprobe wird mit einer bekannten Kopienzahl (Referenzzahl) mit einer

Probe (Ziel) mit einer unbekannten Kopienzahl verglichen.

➔ Methode funktioniert nur, wenn die Amplikationseffizienzen sehr ähnlich sind

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Beispielhafte Karteikarten für deinen Molekularbiologische UE Epigenetik Kurs an der Universität für Bodenkultur Wien - von Kommilitonen auf StudySmarter erstellt!

Q:

Beschreiben Sie die verschiedenen Phasen einer PCR! Was braucht man für einen PCR Ansatz?

A:

a) Siehe Frage 15

b) - DNA-Lsg

- 2 Primer

- die 4 verschiedenen Desoxynukleotide: dATP, dCTP, dGTP, dTTP

- thermostabile DNA-Polymerase (zB Taq)

- dH2O

-Mg2+

-geeignete Pufferlösungen geeignet für DNA-Pol

Q:

 Aufreinigung eukaryontischer DNA

A:

1) Zelllyse (mit Puffer → enthält Endoproteasen Proteinkinase K, Degradierung von zellulären Proteinen und SDS denaturiert)

2) Entfernung der RNA durch Verdauung mit Endoribonuklease (RNAse)

3) Entfernung zelluläre Proteine mit e. Salz-Ausfällungsschritt

4) Anreicherung der DNA über Ausfällung mit Isopropanol

5) Ausgefällte DNA wird in einem Puffer aufgelöst

Q:

Sichtbarmachung von Proteinen auf Western Blot

A:

vorgefärbten Proteinmarkern -> Bestätigung des Transfers auf Membran anschließende Bestimmung der Größe des Zielproteins. 

Proteine, die an Nitrocellulose und PVDF-Membranen gebunden, mit Ponceau S gefärbt werden, bindet an positiv geladenen AS Gruppen der Proteine. Färbung zur Überwachung einer gleichen Beladung und den Transfer der Proteine zu. Die Färbung leicht durch Inkubation in Wasser od. NaOH entfernt werden. Anschließend immunologische Detektion.

Q:

Welche Funktion hat ein Kalibrator bei qPCR und auch das Referenzgen beschreiben

A:

Kalibrator = Eine einzelne Referenzprobe verwendet als Grundlage für den relativen Anstieg der Expressionsstudie (Annahme: konstanten Reaktionseffizienz). Dient zur Berechnung der Anzahl der kopierten Gene. 

Bestimmung der Genkopieanzahl: Kalibrationsprobe mit bekannten Kopieanzahl (Referenz) wird mit Probe (Ziel) mit unbekannten Kopieanzahl verglichen. Amplifikationsseffizienz der beiden muss sehr ähnlich sein. 

Referenzgen = Gene, die weit verbreitet sind, Annahme: konstanten Expression, werden als Referenzgene für die Normierung in qPCR verwendet.

Q:

Wie macht man eine positiv bzw. negativ Kontrolle beim PCR?

A:

+ Kontrolle : zeigt prinzipielle funktionsweise der Reaktion an, zB bekannter DNA

Abschnitt um sicher zu gehen ob die Reaktion wirklich funktioniert hat

- Kontrolle: (meist ohne Zugabe von DNA) : zeigt Kontamination an, oft dH2O

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Q:

E-Value/Wert bei BLAST-Analyse beschreiben

A:

Expecting Value E: basiert auf der Größe der analysierten Sequenz und auf der

Summe der Größen aller im Sequenzvergleich verwendeten Sequenzen.

E = mn / 2^(-S`)

Je kleiner der resultierende E-Wert, desto unwahrscheinlicher ist das Auftreten einer zufälligen Angleichung. E-Werte > 0,001 (dh. 1 e^-3) werden als statistisch nicht signifikant betrachtet.

Q:

Denkbeispiel: Sequenz (5'-CmCGG-3') mit Bisulfit behandelt und anschließend

mit PCR vervielfacht. Anschließend noch mit Restriktionsenzymen schneidbar die 

5'-CCGG-3' erkennen?

A:

Nein. 5'-CmCGG-3' wird nach Bisulfit-Behandlung zu 5'-CmUGG-3'. Dies kann das

Restriktionsenzym nicht mehr erkennen.

Q:

Ist es sinnvoll mehr als 40 PCR Runden zu machen?

A:

Nein, da die höchste Effizienz in den ersten wenigen Zyklen der PCR beobachtet

(exponentielle Phase) wird. In den späteren Phasen verläuft die Reaktion mit geringerer

Effizienz und erreicht schließlich die Beschränkungen an der Anzahl der DNAPolymerasemoleküle (d.h weniger als die Anzahl an DNA-Vorlagesträngen)

- Beschränkungen an der Anzahl der DNA-Polymerasemoleküle 

- Halbwertszeit der thermostabilen DNA-Polymerase (Taq-Polymerase bei 95°C = 40min.)

- Beschränkung in der Anzahl von dNTPs oder DNA-Oligonukleotiden (Primer) in

späteren Phasen der PCR

- Re-Annealing von Produkt-DNA-Einzelsträngen stört das effiziente Anlagern von

DNA-Oligonukleotiden (Primern) an ihre entsprechenden Matrizenstränge

Q:

qPCR 3 Detektionsmethoden angeben/erklären

A:

a.) sequenzspezifisch: basierend auf FRET

-Hydrolisierungsproben (Taqman)

-Hybridisierungsproben (molecular beacon, LUX primers)

ein Mechanismus, bei dem Energie zw 2 lichtsensitiven Chromophoren transferiert wird. Geamte freigesetzte Anregungsenergie des Reporters wird vom Quencher gefangen. Quencher wird ducrh zb Taq-Polymerase entfernt, Reporter freigegeben

Hybridisierungsproben (DNA Fragment markiert) transferieren die Energie zu 2. Chromophor, welches langwelligeres Licht freilässt als die anregende Wellenlänge und die Emission   von der ersten Probe

b.) nicht sequenzspezifisch

Verwendung von Floureszenzfarbstoffen, die sich in die DNA Doppelhelix einlagern zb. SYBR-Green 

Vorteil: Ziel-Spezifikation, präzise&sensitiv

Nachteil: teuer

Q:

Western-Blot Komponenten:

A:

1. SDS-Page-gel

2. Einheit die elektr. Strom generiert

3. Elektrophorese Equipment

4. El. Puffer

5. Protein Transfer Einheit

6. Übertragungspuffer

7. Waschpuffer

8. Blocking Lösung

9. Primary antibody

10. Secondary Antibody (nur benötigt, wenn primary antibody nicht konjugiert ist)

11. Substrat für Enzym zB HRP-Substrat

12. X-Ray Film + Fixierer

13. Und Entwicklungslösung oder „imaging system“

Q:

Wofür wird RNAse verwendet bei der gDNA Reinigung + generell gDNAReinigung.

A:

4-Schritte Prozess. 

1. Zelle lysiert.Puffer aus SDS und Proteinkinase K. zelluläre Proteine werden abgebaut. 

2. Zelllysate mit RNase verdaut, um RNA zu entfernen (darf keine DNase enthalten). 

3. zelluläre Proteine mit konz. NaCl gefällt und per Zentrifugation entfernt. Im 

4. wird die genomische DNA mit Isopropanol gefällt.

5. wird sie erneut in einem Puffer gelöst.

Q:

Verwendung Calibrator PCR

A:

Bestimmung der Genkopienummer:

Eine Kalibrierprobe wird mit einer bekannten Kopienzahl (Referenzzahl) mit einer

Probe (Ziel) mit einer unbekannten Kopienzahl verglichen.

➔ Methode funktioniert nur, wenn die Amplikationseffizienzen sehr ähnlich sind

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