Molbio Lecaudey at Universität Frankfurt am Main

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Typen der Restriktionsendonukleasen

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Gelelektrophorese

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Symmetrie der Erkennungssequenzen

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Welche Enzyme sind für die rekombinante DNA-Technologie erforderlich?

3 Beispiele

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Welche sind die grundlegenden Methoden der rekombinanten DNA-Technologie?

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Enden der RE

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Polymerase Chain Reaction (PCR)

Definition und Anwendung

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Größe der Restriktionsfragmente

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Gelelektrophorese

2 Gele und Unterschiede

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Klonierung

Plasmidvektoren 3 Eigenschaften erforderlich

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Was sind Restriktionsendonukleasen (oder Restriktionsenzymen, RE)?

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Polymerase Chain Reaction (PCR)

Ablauf

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Molbio Lecaudey

Typen der Restriktionsendonukleasen

Typ I oder III

DNA-Spaltung an zufälligen Stellen

Typ II

DNA-Spaltung an spezifischen Sequenzen. Spaltung innerhalb der Erkennungsseequenz

Typ IIS

DNA-Spaltung außerhalb der Erkennungssequenz auf einer Seite

Molbio Lecaudey

Gelelektrophorese

Gelelektrophorese trennt DNA-Fragmente verschiedener Größe auf 

  • Nukleinsäure Moleküle sind negativ geladen (Phosphatgruppen): sie wandern zur positiven Elektrode
  • Das Gel wirkt wie ein Molekularsieb: größere DNA-Fragmente wandern langsamer in der Gelmatrix 
  • DNA-Fragmente je nach Größe über das Gel verteilt. 


  • Die DNA/RNA-Bänder sollen sichtbar gemacht werden 
  • Mit fluoreszierenden Molekülen, die sich in DNA/RNA einlagern
  • Mit radioaktiven Nukleotiden (siehe DNA Sequenzierung) 

Molbio Lecaudey

Symmetrie der Erkennungssequenzen

  • Eine Nucleotidsequenz ist ein Palindrom, wenn die beiden Stränge gegenläufig dieselbe Sequenz aufweisen 
  • Die Enzyme lagern sich an den entsprechenden Abschnitt an und schneiden den DNA-Doppelstrang in charakteristischer Weise durch.

Molbio Lecaudey

Welche Enzyme sind für die rekombinante DNA-Technologie erforderlich?

3 Beispiele

  • Ligase
  • DNA-Polymerase I
  • Reversetranskriptase

Molbio Lecaudey

Welche sind die grundlegenden Methoden der rekombinanten DNA-Technologie?

  1. Zerschneiden der DNA
  2. DNA-Ligation
  3. DNA-Klonierung
  4. Die Polymerasen-Kettenreaktion
  5. Synthese von cDNA
  6. Bestimmung der mRNA Konzentration in der Zelle (mit Echtzeit PCR)
  7. Herstellung von Genbanken und cDNA-Banken
  8. Schnelle Bestimmung der Sequenz von Nukleotiden


Molbio Lecaudey

Enden der RE

RE können verschiedene Enden produzieren: 5’ oder 3’ Überhänge oder glatte Ende.

  • Viele RE schneiden DNA-Stränge auf versetzte Weise ➜ Fragmente mit einzelsträngigen Schwänzen entstehen („sticky ends“) 
  • Andere schneiden beide Stränge in der Mitte des Palindroms ➜ glatte Enden entstehen. 
  • Komplementäre “Sticky ends” von zwei DNA Fragmente können Wasserstoffbrücken bilden und durch das Enzym DNA-Ligase kovalent verknüpft werden.

Molbio Lecaudey

Polymerase Chain Reaction (PCR)

Definition und Anwendung

Die Polymerasekettenreaktion ist eine starke Technik Zur Vervielfältigung von DNA-Abschnitten.


Anwendungen (Beispiele):

  • Vaterschaft
  • Forensic
  • Analyse fossiler DNA

Molbio Lecaudey

Größe der Restriktionsfragmente

Einige Enzyme schneiden das Genom häufiger als andere.

Die Spaltungsfrequenz eines bestimmten Restriktionsenzyms bestimmt die Größe der Restriktionsfragmente.

Molbio Lecaudey

Gelelektrophorese

2 Gele und Unterschiede

  • Agarose Gel
    • Horizontal gegossenes Gel
    • ungiftig
    • trennt große Moleküle
    • Häufig verwendet für die Trennung von DNA-Fragmenten
  • Polyacrylamide Gel
    • vertikal gegossenes Gel
    • stark neurotoxisch
    • trennt kleine Moleküle
    • Verwendet für Proteine oder DNA-Trennung

Molbio Lecaudey

Klonierung

Plasmidvektoren 3 Eigenschaften erforderlich

  1. „Origin“ für die Replikation
  2. „Multiple Cloning Site“ (MCS)
  3. ntibiotikaresistenzgen für die Selektion

Molbio Lecaudey

Was sind Restriktionsendonukleasen (oder Restriktionsenzymen, RE)?

  • Restriktionsenzyme sind ein Verteidigungsmechanismus der Bakterien gegen Fremd-DNA, insbesondere Phagen-DNA. 
  • Jedes RE bindet an eine spezifische Nucleotidsequenz (Erkennungssequenz) und schneidet beide Stränge nach einem spezifischen Spaltungsmuster

Molbio Lecaudey

Polymerase Chain Reaction (PCR)

Ablauf

PCR ist einer Reihe von in vitro Reaktionen, die DNA Fragmente vervielfältigen 

  • Die PCR-Reaktion ist eine Reihe von 25- 35 Zyklen mit 3 Schritten 

Zyklus 1

  • Schritt 1: Denaturierung der DNA
  • Schritt 2: Primerbindung (Annealing)
  • Schritt 3: Verlängerung

Das Produkt des ersten Zyklus verdoppelt die Anzahl neuer DNA-Moleküle.

Zyklus 2

  • Kettenreaktion: die Anzahl neuer DNA- Stränge bei jedem Zyklus wird verdoppelt -> Matrizen für den nächsten Zyklus
  • führt zu einer millionenfachen Vergrößerung der DNA-Menge 

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