Methodische Biologie at Universität Erlangen-Nürnberg

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Methoden der Proteinbestimmung

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Zentrifugationstechniken

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Welche Zentrifugationstechniken gibt es? Beschreibe diese!

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Wie ist die Antikörperfärbung?

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Was für Fehler können einem beim Erstellen von Diagrammen unterlaufen?

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Therapeutische Antikörper

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Was sind Konfidenzintervalle? 

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Fluoreszenz

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Welche Eigenschaften werden genutzt, um Proteine/ Enzyme durch Chromatographie auseinanderzuziehen?

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Was erreicht man durch Mischung von verschiedenen Zentrifugationstechniken? Beispiel angeben.

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Licht

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Weshalb erkennen die meisten Restriktionsenzyme Palindrome in der DNA?

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Methodische Biologie

Methoden der Proteinbestimmung

  • kolorimetrische Methode (Färbetest, sensitiver als Spektroskopie)
  • spektroskopische Methoden (unempfindlich und störanfällig nur bei reinen Proteinen)

Methodische Biologie

Zentrifugationstechniken

  • Differenzielle Zentrifugation 
  • Trennung in einem Dichtegradienten 
  • Geschwindigkeitszentrifugation
  • Gleichgewichtszentrifugation
  • Ultrazentrifugation

Methodische Biologie

Welche Zentrifugationstechniken gibt es? Beschreibe diese!

- Differentielle Zentrifugation:

   > Voraussetzung: Unterschied in der Sedimentationsgeschwindigkeit der zu trennenden Partikel

   > Zentrifugalkraft trennt Partikel, die sich in Masse und/oder Dichte unterscheiden -> niemals vollständige Trennungen

   > Pellet bildet sich

   > bei Ablauf von mehreren Zentrifugationsschritte von unterschiedlichen Längen können nach jedem Schritt andere Zellorganellen sedimentieren und danach entfernt werden (Kerne -> Chl., Mit., Lys., Per. -> Mirkosomen, ER, PM, Polyrib. -> rib. UEs, Polyrib. -> Cytosol)


- Trennung in einem Dichtegradienten:


   > Geschwindigkeitszentrifugation (Zonenzentrifugation): Auftrennung von Teilchen mit ähnlicher Sedimentationsgeschw., aber unterschiedl. Größe

Partikel bandieren und wandern im Gradienten nach unten. Abbruch der Zentrifugation, bevor die Partikel pelletieren. Maximale Dichte des Gradienten (Mediums) muss unterhalb der niedrigsten Dichte der zu trennenden Partikel liegen.

 

 > Gleichgewichtszentrifugation (isopyknische Zentrifugation): Auftrennung von Teilchen mit ähnlicher Größe, aber unterschiedl. Dichte

Partikel bandieren im Gradienten dort wo das Medium die gleiche Dichte wie der Partikel hat.

Trennung von Partikeln ähnlicher Größe, aber unterschiedlicher Dichte, möglich.


- Ultrazentrifugation

Erfolgt im Vakuum; 50.000-100.000 Umdrehungen pro Minute

Methodische Biologie

Wie ist die Antikörperfärbung?

Grün: Mikrotubuli-assoziiertes Protein 2 Marker für Dendriten

Rot: Synaptophysin Marker für Präsynapsen

Methodische Biologie

Was für Fehler können einem beim Erstellen von Diagrammen unterlaufen?

  1. Daten werden nicht gezeigt
  2. Muster sind schwer erkennbar
  3. Größenordnungen werden verzehrt
  4. Graphische Elemente sind unklar

Methodische Biologie

Therapeutische Antikörper

  • 20 monoklonale AK für Therapie zugelassen
  • viele in Entwicklung
  • hohes Marktvolumen 
  • zB bei Tumortherapie ; Multiple Sklerose
  • Genutzt in Schwangerschaftstest und Fertilitätstest 

Methodische Biologie

Was sind Konfidenzintervalle? 

=Wertebereich, der den Schätzwert eines unbekannten Parameters mit einer großen Wahrscheinlichkeit einschließt

  • zB bei einem 95%igen-Konfidenzinterval liegt der wahre Wert des Parameters mit einem Vertrauen von 95% in diesem Intervall
  • Je größer das Konfidenzintervall, desto unzuverlässiger ist der Schätzwert
  • Der aus der Zufallstichprobe gewonnene Schätzwert kann erheblich vom tatsächlichen (uns unbekannten) Wert abweichen. Das gilt insbesondere für kleine Stichproben

Methodische Biologie

Fluoreszenz

Fluoreszenz


Fluorochrome/ Fluorophore
Moleküle die nach Anregung mit bestimmten Licht Photonen emittieren

Methodische Biologie

Welche Eigenschaften werden genutzt, um Proteine/ Enzyme durch Chromatographie auseinanderzuziehen?

Ladung bei Ionenaustauschchromatographie

Größe bei Gelfiltration

Affinität/ Aktivität bei Affinitätschromatographie

Polarität/ Löslichkeit bei hydrophober Interaktionschromatographie/ Reverse Phase Chromatographie

Methodische Biologie

Was erreicht man durch Mischung von verschiedenen Zentrifugationstechniken? Beispiel angeben.

Damit erreicht man meist das gewünschte Ziel


- Bsp.: Isolierung von Geißeln aus Chlamydomonas:

   > pH-Schock ins leicht saure -> Geißeln werden abgetrennt

   > Zentrifugation -> Pellet aus Bakterium und wenigen Geißeln

   > um restliche Zellen zu entfernen: Saccharose zugeben und Gleichgewichtszentrifugation -> Zellen sinken ab in den Gradienten und Geißeln bleiben als Überstand zurück

Methodische Biologie

Licht

Licht



  • elektromagnetische Strahlung die von der Sonne ausgeht
  • zugleich Welle und Teilchen
  • hat Frequenz und Wellenlänge


Methodische Biologie

Weshalb erkennen die meisten Restriktionsenzyme Palindrome in der DNA?

Diese Sequenzspezifität beruht auf der Tatsache, dass die meisten Restriktionsenzyme als Dimere binden und daher konsequenterweise zwei gleiche Erkennungssequenzen nebeneinander liegen müssen (aus sterischen Gründen auf jeweils dem "sense" und "antisense" Strang)

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