Grundlagen der molekularen Bioanalytik at TU Dresden

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Dünnschichtchromatographie

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Funktionsprinzip der Chromatographie

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Ergebnisse der Chromatographie


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Ursache für Breite der Banden


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Elutrope Reihe

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BioLC

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Größenausschlussverfahren (SEC)

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Voraussetzungen SEC 

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Größenbestimmung

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Regeln für Seperation bei IEC

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Affinitätschromatographie (AC)

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Metallchelatchromatographie (IMAC)


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Grundlagen der molekularen Bioanalytik

Dünnschichtchromatographie

- Verfahren, dass Auftrennung von Stoffen erzielt, indem deren unterschiedliche Wechselwirkungen mit stationären und mobilen Phase genutzt wird

 - Kann im (semi)-präperativen Maßstab genutzt werden 

- Eluent → mobile Phase

Grundlagen der molekularen Bioanalytik

Funktionsprinzip der Chromatographie

• Auswirkung auf die Verteilung haben die Löslichkeit des Moleküls, die Größe, die Ladung und die funktionelle Gruppe • S interagiert mit MP und SP, die Bewegung von S verlangsamt sich = Verteilungskoeffizient KS = cSP/ cMP → liegt dieser unter 0 → hohe Bindung an mobile Phase & somit schnelle Wanderung → der Verteilungskoeffizient beschreibt die Verteilung einer Komponente zwischen zwei Phasen

Grundlagen der molekularen Bioanalytik

Ergebnisse der Chromatographie


- Inneres Chromatogramm 

-> WW zwischen Analyt und MP hoch → läuft schnell  

-> WW zwischen Analyt und SP hoch → läuft langsam → daraus Bestimmung des Retentionsfaktors (Rf): Kenngröße einer Substanz unter spez. Bedingungen 𝑅𝑓= 𝑠x/𝑠𝑓 → der Rf – Wert gibt das Laufverhalten der aufgetrennten Substanzen an Sx: Laufdistanz Analyt Sf: Laufdistanz mobile Phase 𝑅𝑠𝑡 = sx/ sRef

SRef: Laufdistanz Referenzsubstanz

Grundlagen der molekularen Bioanalytik

Ursache für Breite der Banden


1. Eddy-Diffusion: Probemolekül läuft nicht linear, sondern im „Zick-Zack“ 2. Moleküle in der Mitte zwischen zwei Säulenpartikeln schneller, als näher an den Partikeln → Strömungsverteilung 3. Diffusion der Probemoleküle in mobiler Phase → Längsdiffusion 4. Stoffaustauschphänomen zw. MP & SP und der in Poren eingeschlossenen „stagnierenden“ MP

Grundlagen der molekularen Bioanalytik

Elutrope Reihe

- Sortiert gängigsten organ. LöMis nach ihrer Elutionswirkung → ist die Fähigkeit des LöMis, eine Substanz mitlaufen zu lassen • Die Anordnung erfolgt empirisch und ist abhängig von der verwendeten SP; korreliert meist mit Dielektrizitätskonstante 

- Bei Kieselgel: n-Hexan, Cyclohexan, Toluol, Benzol, Diethylether, Chloroform, Methylenchlorid, Tetrahydrofuran, Aceton, Dioxan, Essigsäureethylester(Ethylacetat), Acetonitril, Pyridin, 1-Propanol, Ethanol, Methanol, Wasser, Dimethylformamid → dabei ist Hexan am langsamsten

Grundlagen der molekularen Bioanalytik

BioLC

- Chromatographie biologischer Makromoleküle (Biopolymere) 

- Trennung von Nukleinsäuren, Proteine, Polysaccharide, Fette → Fette sind eigentlich keine Polymere 

- Schonende Trenntechnik, v.a. für Proteine → bei anderen Trennmethoden bleibt die Aktivität der Proteine nicht erhalten

Grundlagen der molekularen Bioanalytik

Größenausschlussverfahren (SEC)

- Trennkriterium ist effektive Größe

- Elution mit organ. LöMi → Gelpermeationschromatographie (GPC) → Trennung von organ. Polymeren an porösen hydrophoben Trennphasen auf Styren-Divinylbenzen- Basis chromatographiert → hier geht Proteinaktivität verloren 

- Für Biopolymere Gelfiltration (GF) → kaum Denaturierungserscheinungen; im folgenden erklärt 

- SP sind Polyacrylamid, Agarose oder Dextrane die mit Wasser gequollen sind (hydrophil) → daher Quervernetzung mit definierter Porengröße (normalerweise 100nm; unterschiedlich je nach zu trennendem Stoff) 

- Zu große Moleküle für das Netz werden einfach von der MP mitgetragen → so schnell wie die MP Phase läuft 

- Kleinere Moleküle sind langsamer, je weiter sie in Poren eindringen können, desto langsamer

Grundlagen der molekularen Bioanalytik

Voraussetzungen SEC 

- Probenauftragsvolumen ≤ 5% vom Volumen der SP (optimal 0,1-1%) • Geringer Viskositätsunterschied zwischen Probe und MP → keine konzentrierten Proteinproben verwendbar, da sich sonst die Viskosität von MP und Probe zu stark unterscheiden; muss verdünnt werden 

- Salzkonzentration von 0,15 mol/l als Minimum → sehr gering damit keine WW entstehen • Geringe Aufnahmekapazität der Säule → können nur wenige Moleküle binden; für mehr Moleküle ist größere Säulen nötig

Grundlagen der molekularen Bioanalytik

Größenbestimmung

• Moleküle von denen man weiß wie groß sie sind werden unter definierten Bedingungen chromatografiert

Grundlagen der molekularen Bioanalytik

Regeln für Seperation bei IEC

- Rt sinkt mit steigender Ionenstärke der mobilen Phase 

- Rt steigt mit sinkender Elutionsstärke der Gegenionen in der MP → Elutionsstärke von Anionen Citrat > SO4 3- > Oxalat > I- > NO3 - >Br- > SCN- > Cl- > OH- → Elutionsstärke von Kationen Ba2+>Ca2+>Ni+>Cd2+>Cu2+>Co2+>Zn2+>Mg2+ >Ag+>Cs+>K+>NH4 > Na+>H+>Li+

- Für starke Anionen- und Kationentauscher, Rt sinkt mit sinkendem und ansteigendem pH-Wert 

- Für schwache Anionen- und Kationentauscher, Rt sinkt mit sinkendem und ansteigendem pH-Wer

Grundlagen der molekularen Bioanalytik

Affinitätschromatographie (AC)

- Trennkriterium sind biospezifische WW 

- Sehr spezifische Methode • Grundlage sind Liganden (funktionelle Gruppen), die meist über flexible Molekülgruppe an eine Matrix kovalent gebunden & mit Biomolekülen biospezifische WW eingehen → biologisch aktive Liganden sind Antigene, Lektine, Rezeptoren, Enzyme oder Hormone an Trägermatrix immobilisiert → Eigenschaften davon sind so gewählt, dass sie Probemolekül weitestens entspricht • Gebundene Enzyme zeigen WW z.B. mit Inhibitoren, Lektine mit Glykoproteinen oder Antikörper mit Antigenen

  • Funktioniert nach Schlüssel-Schloss-Prinzip

→ nur spezifische Moleküle binden → Bindung über Wasserstoffbrückenbindungen, Van-der-Waals-WW, ionische Interaktionen, z.T. milde hydrophobe WW & biospezifische Bindungen

- Danach neuer Puffer, der durch veränderten pH-Wert Kopplungen entbinden 

- Aus sterischen Gründen können großvolumige Moleküle nicht direkt binden → daher Einbau langkettiger Spacer zwischen Matrix & Ligand 

- Bevorzugtes Matrixmaterial Polyarylamid oder hydrophile Agarose

Grundlagen der molekularen Bioanalytik

Metallchelatchromatographie (IMAC)


- Trennkriterium ist Komplexierung von Kationen

• Spezialmechanismus der Affinitätschromatographie 

- zur Isolierung heterolog exprimierter Proteine

• Methodik basiert darauf, dass Proteinmotive mit mehreren Histidin- oder Cystidin-Resten mit kovalente Metallchelate in geeigneter Anordnung an SP andocken

- Eluiert wird mit Imidazol-Lösung im Batch-Verfahren/ Gradient oder durch Veränderung des pH-Werts

• Die poly-His-Sequenzen interagieren mit zweiwertigen Kationen, die durch Nitrilotriessigsäure komplexiert sind

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