Bioanalytik at TU Dresden | Flashcards & Summaries

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Lernmaterialien für Bioanalytik an der TU Dresden

Greife auf kostenlose Karteikarten, Zusammenfassungen, Übungsaufgaben und Altklausuren für deinen Bioanalytik Kurs an der TU Dresden zu.

TESTE DEIN WISSEN

analytische Ziele allgemein

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TESTE DEIN WISSEN

- Länge

- Menge: Konzentration

- Reinheit: 

- Identiät: MOlekülart (Sequenz, Konformation, Bausteine, 3DStruktur)

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TESTE DEIN WISSEN

Elektrophorese Ziele und Vorteile

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TESTE DEIN WISSEN

- Länge, Reinhiet

  • Menge nur begrenzt (nur in Teil des Analyts aufgetragen, ab bestimmter Konzentration verschwimmt das Bild)

- Vorteile der ELektrophorese

  • hohe Genauigkeit
  • breiter Größenbereich der Trennung: unterschiedlich große Analyten
  • schnell und günstig
  • geringe Analytmengen: hohe Genauigkeit
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TESTE DEIN WISSEN

Herstellung Agarosegele

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TESTE DEIN WISSEN

- Prozess

  • Erhitzen der Agaroselösung, Ausgießung auf Gelschlitten, Auskühlung
  • Geldicke abhängig von dem Volumen der Lösung und der gegossenen Fläache

Eigenschaften des Gels

  • Unterscheidung in Mini, Midi und MAxi Gele: Trennstrecke 
    • 6-8cm: keine genaue Bestimmung, Charakterissierung von Art und Menge, Überprüfen von Restriktionsspaltungen
    • ca. 20cm: genaue Fragmentcharakterisierung
    • 30-40cm: 
  • Schmleztemperatur der Gele zwischen 35-95°C
  • unterscheidliche Elektroendosmose
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TESTE DEIN WISSEN

Elektrophorese Definition

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TESTE DEIN WISSEN

Migration geladener Teilchen in einem elektrischen Feld: Analyse geladener Moleküle

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TESTE DEIN WISSEN

zu beachten bei Durchführung & Möglichkeitne zu verbessern

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TESTE DEIN WISSEN

wichtige Durchführungshinweise

- Puffer muss Gel bedecken: kein Kurzschluss

- Probelösung in die Taschen einlassen ohne das Gel zu punktieren

- Spannung und Zeit richtig einstellen

- Gelorientierung nach SPannungsgeber

- Probe soll in der Tasche bleiben

eventuelle Verbesserungsmöglichkeiten

  • Glycerin od. Saccharose od. Ficoll: Probendichte erhöht, Diffusion im Puffer verringert
  • eventuell Einfärbung der Probe mit Farbe als Marker (hilft bei der Durchführung) z.B. Bromphenolblau oder Xylencyanol
    • Färbung im Trenngel ermöglicht Beobachtung der Wanderung
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TESTE DEIN WISSEN

vertikale vs. horizontale Gelkammern

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TESTE DEIN WISSEN

- Vorteile horizontal (für Nukelinsäuren)

  • keine großen Puffervolumina oder Tanks notwendig
  • keine Abdichtung der Pufferkammern notwendig
  • dünnere Trennschichten möglich (Kühlung einfacher, schnellere Läufe, schärfere Zonen)
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TESTE DEIN WISSEN

DNA vs RNA bei pH-Wert-Änderung

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TESTE DEIN WISSEN

- DNA liegt normalerweise als Doppelhelix vor, RNA als EiInzelstrang: durch Änderung des pH-Wertes kommt es zum Denautrierung der DNA aber sie ist trotzdem stabiler als RNA

  • Zugabe starker Basen: pH-Wert drastisch erhöht, wodurch die Wasserstoffionenkonzentration der Lösung verringert wird => reich Hydroxidionen (negative geladene Ionen): können Wasserstoffionen von Molekülen
  • unterbricht die wasserstoffreiche Wasserstoffbrückenbindung

RNA fehlt der DNA in jeder Zuckergruppe eine Hydroxylgruppe an der 2'-Position

  • Hydroxylgruppe an der 2'-Position gibt bei hohem pH-Wert ein Wasserstoffion an die Lösung ab, wodurch ein hochreaktives Alkoxidion entsteht, das die Phosphatgruppe angreift, die zwei benachbarte Nukleotide zusammenhält
  • Instabilität der RNA bei hohen pH-Werten


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Marker Gelelektrophorese

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TESTE DEIN WISSEN

- Fragmente mit genau definierten Größen: Längenstandard

  • muss in ähnlichen Mengen und gleichem Puffer wie Analyt aufgetrennt werden für vergleichbare Lösungen
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TESTE DEIN WISSEN

Bedeutung Puffer Elektrophorese

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TESTE DEIN WISSEN

Puffer übertragen die zur Trennung erforderliche LAdung

  • hält pHWert in einem engen Bereich sodass Auftrennung der Analytne nach Ladung möglich ist 
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TESTE DEIN WISSEN

Trennprinzip der Elektrophorese (2Prinzipe)

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freie Elektrophorese

  • Moleküle in einer Pufferlösung
  • geringe Viskosität
  • Auftrennung nach Ladung (hauptsächlich)
  • freie Konvektion und Diffusion, besonders durch Wärme welche frei wird

Trägerelektrophorese

  • gepuffertes Gel
  • hohe Viskosität
  • Auftrennung nach Ladung und Größe
  • Kenvektion und Diffusion verhindert

=> hauptsächlich wird Viskosität n durch die Trägermethode erhöht: elektrische Mobilität der Teilchen nimmt ab

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TESTE DEIN WISSEN

Restriktionsverdau

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TESTE DEIN WISSEN

- Inkubaiton der DNA mit ausgewählten Restriktionsenzymen bei definierten Pufferbedingungen und definierter Temperatur

- je nach Inkubationszeit, Temperatur, Menge an Enzym und Puffer unterscheidliche Stärker der Restriktion

  • nicht optimierte Bedingungen fürht nur zur partiellen Restriktion


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Nukleinsäurefärbung im Trenngel (Fluoreszenz)

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- Interkalierung mit fluoreszierenden Farbstoffen während der Elektrophorese

  • Standardmethode Ethidiumbromid: interkaliert bevorzugt in dopelsträngige DNA, wechselwirkt mit plananren Heterozyklen der DNA
    • durhc Wellen von 254-366nm angeregt, emittiert orange-rotes Licht im bereich von 590nm
    • EtBr reduziert Mobilität um 15%
    • Detektion von 10-20ng DNA (je nach Fragmentlänge unterschiedlich)
    • Nachteile
      • keine Trennung von RNA
      • muss nachdosiert werden weil EtBr zur KAthode wandert
      • mutagene Wirkung: 
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Q:

analytische Ziele allgemein

A:

- Länge

- Menge: Konzentration

- Reinheit: 

- Identiät: MOlekülart (Sequenz, Konformation, Bausteine, 3DStruktur)

Q:

Elektrophorese Ziele und Vorteile

A:

- Länge, Reinhiet

  • Menge nur begrenzt (nur in Teil des Analyts aufgetragen, ab bestimmter Konzentration verschwimmt das Bild)

- Vorteile der ELektrophorese

  • hohe Genauigkeit
  • breiter Größenbereich der Trennung: unterschiedlich große Analyten
  • schnell und günstig
  • geringe Analytmengen: hohe Genauigkeit
Q:

Herstellung Agarosegele

A:

- Prozess

  • Erhitzen der Agaroselösung, Ausgießung auf Gelschlitten, Auskühlung
  • Geldicke abhängig von dem Volumen der Lösung und der gegossenen Fläache

Eigenschaften des Gels

  • Unterscheidung in Mini, Midi und MAxi Gele: Trennstrecke 
    • 6-8cm: keine genaue Bestimmung, Charakterissierung von Art und Menge, Überprüfen von Restriktionsspaltungen
    • ca. 20cm: genaue Fragmentcharakterisierung
    • 30-40cm: 
  • Schmleztemperatur der Gele zwischen 35-95°C
  • unterscheidliche Elektroendosmose
Q:

Elektrophorese Definition

A:

Migration geladener Teilchen in einem elektrischen Feld: Analyse geladener Moleküle

Q:

zu beachten bei Durchführung & Möglichkeitne zu verbessern

A:

wichtige Durchführungshinweise

- Puffer muss Gel bedecken: kein Kurzschluss

- Probelösung in die Taschen einlassen ohne das Gel zu punktieren

- Spannung und Zeit richtig einstellen

- Gelorientierung nach SPannungsgeber

- Probe soll in der Tasche bleiben

eventuelle Verbesserungsmöglichkeiten

  • Glycerin od. Saccharose od. Ficoll: Probendichte erhöht, Diffusion im Puffer verringert
  • eventuell Einfärbung der Probe mit Farbe als Marker (hilft bei der Durchführung) z.B. Bromphenolblau oder Xylencyanol
    • Färbung im Trenngel ermöglicht Beobachtung der Wanderung
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Q:

vertikale vs. horizontale Gelkammern

A:

- Vorteile horizontal (für Nukelinsäuren)

  • keine großen Puffervolumina oder Tanks notwendig
  • keine Abdichtung der Pufferkammern notwendig
  • dünnere Trennschichten möglich (Kühlung einfacher, schnellere Läufe, schärfere Zonen)
Q:

DNA vs RNA bei pH-Wert-Änderung

A:

- DNA liegt normalerweise als Doppelhelix vor, RNA als EiInzelstrang: durch Änderung des pH-Wertes kommt es zum Denautrierung der DNA aber sie ist trotzdem stabiler als RNA

  • Zugabe starker Basen: pH-Wert drastisch erhöht, wodurch die Wasserstoffionenkonzentration der Lösung verringert wird => reich Hydroxidionen (negative geladene Ionen): können Wasserstoffionen von Molekülen
  • unterbricht die wasserstoffreiche Wasserstoffbrückenbindung

RNA fehlt der DNA in jeder Zuckergruppe eine Hydroxylgruppe an der 2'-Position

  • Hydroxylgruppe an der 2'-Position gibt bei hohem pH-Wert ein Wasserstoffion an die Lösung ab, wodurch ein hochreaktives Alkoxidion entsteht, das die Phosphatgruppe angreift, die zwei benachbarte Nukleotide zusammenhält
  • Instabilität der RNA bei hohen pH-Werten


Q:

Marker Gelelektrophorese

A:

- Fragmente mit genau definierten Größen: Längenstandard

  • muss in ähnlichen Mengen und gleichem Puffer wie Analyt aufgetrennt werden für vergleichbare Lösungen
Q:

Bedeutung Puffer Elektrophorese

A:

Puffer übertragen die zur Trennung erforderliche LAdung

  • hält pHWert in einem engen Bereich sodass Auftrennung der Analytne nach Ladung möglich ist 
Q:

Trennprinzip der Elektrophorese (2Prinzipe)

A:

freie Elektrophorese

  • Moleküle in einer Pufferlösung
  • geringe Viskosität
  • Auftrennung nach Ladung (hauptsächlich)
  • freie Konvektion und Diffusion, besonders durch Wärme welche frei wird

Trägerelektrophorese

  • gepuffertes Gel
  • hohe Viskosität
  • Auftrennung nach Ladung und Größe
  • Kenvektion und Diffusion verhindert

=> hauptsächlich wird Viskosität n durch die Trägermethode erhöht: elektrische Mobilität der Teilchen nimmt ab

Q:

Restriktionsverdau

A:

- Inkubaiton der DNA mit ausgewählten Restriktionsenzymen bei definierten Pufferbedingungen und definierter Temperatur

- je nach Inkubationszeit, Temperatur, Menge an Enzym und Puffer unterscheidliche Stärker der Restriktion

  • nicht optimierte Bedingungen fürht nur zur partiellen Restriktion


Q:

Nukleinsäurefärbung im Trenngel (Fluoreszenz)

A:

- Interkalierung mit fluoreszierenden Farbstoffen während der Elektrophorese

  • Standardmethode Ethidiumbromid: interkaliert bevorzugt in dopelsträngige DNA, wechselwirkt mit plananren Heterozyklen der DNA
    • durhc Wellen von 254-366nm angeregt, emittiert orange-rotes Licht im bereich von 590nm
    • EtBr reduziert Mobilität um 15%
    • Detektion von 10-20ng DNA (je nach Fragmentlänge unterschiedlich)
    • Nachteile
      • keine Trennung von RNA
      • muss nachdosiert werden weil EtBr zur KAthode wandert
      • mutagene Wirkung: 
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