Analytische Chemie 2 at Technische Universität Wien

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Flachbett-Gelelektrophorese

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Beschreiben Sie die apparativen Grundlagen der HPLC (v.a. Injektion, Trennsäulen, Detektion). Gehen Sie dabei besonders auf die verschiedenen Arten von Trennsäulen ein und beschreiben Sie, welche Dimensionen, Morphologie und chemische Beschaffenheit diese haben, und welche Arten der HPLC sich davon ableiten lassen. Diskutieren Sie, über welche Faktoren die Trennung beeinflusst (verbessert bzw. beschleunigt) werden kann für die beiden wichtigsten Modi der HPLC.

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Welche Art von Lichtquelle wird bei der Raman Spektroskopie verwendet?

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Was versteht man unter Stokes bzw. Anti-Stokes Streuung?

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Welche mobilen und welche Stationären Phasen werden bei der DC verwendet?

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Welche Charakteristika besitzt DC und welche Vor- und Nachteile hat sie gegenüber der HPLC?

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Welche Lichtquellen werden für Absorptionsmessungen von Atomen und Molekülen im Spektralbereich von 190 nm bis 25 µm (UV-IR) verwendet? Erläutern Sie deren Funktionsweise und benennen Sie deren Einsatzgebiete.

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Wie erfolgt die Wellenlängenkalibration für UV-VIS sowie für FTIR-Spektrometer?

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Was sind digitale Filter im Allgemeinen und welche Vorteile besitzen diese im Vergleich zu Hardware-basierenden Filtern zur Verbesserung des Signal-Rausch-Verhältnisses?

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gleitender Mittelwert-Filter

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Boxcar-Filterung

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Fourier-Filterung

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Analytische Chemie 2

Flachbett-Gelelektrophorese

Die GE ist eine Form der Träger-Elektrophorese. Für die Trennung wird ein Trägermaterial verwendet. Hier wird ein Gel als Träger- sowie Trennphase verwendet. Die Trennung erfolgt nach Molekülgröße und Ladung. Das Gel wird in eine Elektrophorese-Apparatur eingelegt, sodass an einer Seite die Kathode und an der anderen die Anode ist. Das Gel enthält auch eine Pufferlösung. Die Proben werden mit Stempeln auf das Gel aufgetragen, danach wird Strom angelegt und die Proben trennen sich auf. Zur Detektion wird die Gel-Folie in Färbebändern fixiert und eingefärbt. Die Vorteile der GE sind, dass die Trennung sowohl nach Molekülgröße als auch nach Ladung erfolgt. Die Porosität der Gele ist durch die Konzentrationen der eingesetzten Stoffe gut steuerbar. Probleme sind allerdings die Überlagerung der Trennung nach Größe und Ladung, wodurch die Trennung weniger eindeutig wird.

Analytische Chemie 2

Beschreiben Sie die apparativen Grundlagen der HPLC (v.a. Injektion, Trennsäulen, Detektion). Gehen Sie dabei besonders auf die verschiedenen Arten von Trennsäulen ein und beschreiben Sie, welche Dimensionen, Morphologie und chemische Beschaffenheit diese haben, und welche Arten der HPLC sich davon ableiten lassen. Diskutieren Sie, über welche Faktoren die Trennung beeinflusst (verbessert bzw. beschleunigt) werden kann für die beiden wichtigsten Modi der HPLC.

Die Apparate der HPLC (high performance liquid chromatography), haben im Allgemeinen ein Elutionsmittelreservoir, von welchem das Elutionsmittel aus durch die Trennsäule gepumpt wird. Hierfür gibt es verschiedene Pumpen. Oft wird hier die Doppel-Kolbenpumpe verwendet, um eine konstante Flussrate zu gewährleisten. Am Anfang der Trennsäule wird die Probe durch Injektion aufgegeben. Die Probenaufgabe erfolgt über ein Sechsweg-Ventil. Dabei wird zuerst die Probenschleife befüllt, und danach die Probe aus der Probenschleife auf die Säule aufgebracht. In der Trennsäule passiert die Trennung. Nach der Trennsäule wird bei einem Detektor detektiert. Die wichtigsten Detektoren sind Brechungsindex-Detektoren, UV/VIS-Detektoren, Fluoreszenzdetektoren und Elektrochemische Detektoren.


Brechungsindex-Detektor: Der Brechungsindex des Analyten wird gemessen. Durch eine Abnahme der Lichtintensität oder einer Verschiebung des Lichtspots an einer photosensitiven Oberfläche wird die Anwesenheit des Analyten registriert.


UV/VIS-Detektor: Ein monochromatischer Lichtstrahl wird wegen Absorption durch die Probe abgeschwächt.


Trennsäulen: Die Trennsäule ist in der HPLC ein entscheidender Faktor. Bei der normalen HPLC befindet sich die stationäre Phase in 10-25 cm langen Stahlsäulen. Partikeldurchmesser sind 3-10 µm. Bei der normal- phase-Chromatographie ist die stationäre Phase polar, häufig wird hier unmodifiziertes Kieselgel verwendet. Häufiger wird jedoch die reversed-phase-Chromatographie verwendet, wo das Laufmittel polar und die stationäre Phase apolar ist. Die Oberfläche des Kieselgels wird mit Alkyl- oder Phenylgruppen chemisch modifiziert.


Die Trennung bei diesen Arten der Chromatographie kann über die Polarität des Laufmittels (je Apolarer das Laufmittel in der NP-Chromatographie, desto größer die Retention, genau umgekehrt bei RP-HPLC) bzw. über die Partikelgröße beeinflusst werden. Kleinere Partikel verbessern die Trennung, verringern aber die Geschwindigkeit. Verwendet man in der Trennsäule ein Gel als stationäre Phase, ist man bei der Gelpermeations- Chromatographie (eine Form der Size Exclusion Chromatography). Hier werden Säulen relativ großer Dimensionen eingesetzt. Das Gel besitzt eine genau definierte Porosität. Bei der Ionenaustauschchromatographie hat die stationäre Phase ionische Ankergruppen an der Oberfläche. Die Trennsäulen haben eher kleiner Innendurchmesser und Länge. Für die Bioaffinitätschromatographie werden spezielle Enzyme an die stationäre Phase gegeben.

Analytische Chemie 2

Welche Art von Lichtquelle wird bei der Raman Spektroskopie verwendet?

Als Lichtquellen für Raman Spektrometer werden Laser verwendet. Oft sind dies He/Ne- oder Argonionen-Laser. Es können auch Nd:YAG-Laser verwendet werden, die zwar eine geringe Streueffizienz haben, aber durch die störende Fluoreszenz vermieden werden kann. Die Lichtquelle muss auf jeden Fall intensiv und monochromatisch sein.

Analytische Chemie 2

Was versteht man unter Stokes bzw. Anti-Stokes Streuung?

Stokes- und Anti-Stokes-Streuung sind beides Formen der Raman-Streuung. Die Raman-Streuung beschreibt eine inelastische Wechselwirkung von Photonen mit Molekülen, sprich, es kommt zu einer Energieübertragung. Diese ist aber um einiges weniger wahrscheinlich als die Rayleigh-Streuung. Bei einer Raman-Interaktion, sprich einer Wechselwirkung mit Raman-Licht, treten im Raman-Spektrum zusätzlich zur Linie, die von der Rayleigh-Strahlung kommt, noch weitere Linien auf. Diese sind die Stokes’schen und Anti-Stokes’schen Linien, die durch Stokes- und Anti-Stokes-Streuung entstehen. Stokes-Streuung heißt, dass ein Teil der Strahlung beim Zusammenstoß mit dem Molekül Schwingungen anregt, und das Molekül so Energie absorbiert. Das emittierte Photon hat also weniger Energie als das ursprünglich auftreffende Photon. Die Stokesschen Linien erscheinen daher bei kleineren Frequenzen. Die Anti-Stokes-Streuung hingegen kommen daher, dass das emittierte Photon auch noch Schwingungsenergie des Moleküls aufnimmt, also mehr Energie hat, als das ursprünglich auftreffende Photon. Die Anti-Stokesschen Linien sind daher bei höheren Frequenzen.

Analytische Chemie 2

Welche mobilen und welche Stationären Phasen werden bei der DC verwendet?

Bei der DC werden im Normalfall polare stationäre Phasen, z.B. Al2O3 oder Kieselgel (SiO2) verwendet. Für die mobile Phase greift man auf die Eluotrope Reihe zurück, um verschieden polare Lösungsmittel zu verwenden (z.B. Hexan, CCl4, Benzol, Diethylether oder Wasser). Durch die Polarität kann man die Retentionszeiten beeinflussen.

Analytische Chemie 2

Welche Charakteristika besitzt DC und welche Vor- und Nachteile hat sie gegenüber der HPLC?

Vorteile: • Alle Trennprinzipien realisierbar • Schnelle Trennung • Gute Empfindlichkeit • Zahlreiche Detektionsmöglichkeiten • Qualitative und quantitative Analyse • Minimale Probenvorbereitung

Nachteile: • HPLC ist wesentlich einfacher präparativ verwendbar • Wesentlich leichter, quantitative Information bei der HPLC zu bekommen • Weniger Leistungsfähig als HPLC • Weniger Variationsmöglichkeiten als HPLC

Analytische Chemie 2

Welche Lichtquellen werden für Absorptionsmessungen von Atomen und Molekülen im Spektralbereich von 190 nm bis 25 µm (UV-IR) verwendet? Erläutern Sie deren Funktionsweise und benennen Sie deren Einsatzgebiete.

In der Infrarotspektroskopie werden als Lichtquellen für die MIR Globar oder Nernst-Stifte verwendet. Globars sind Silizium-Kohlenstoffstäbe, welche elektrisch erhitzt werden, um IR- Strahlung zu erzeugen. In der NIR können Quarz- und Halogenlampen verwendet werden. In der FIR werden Hg-Dampf Lampen verwendet. Quecksilberdampflampen sind Gasentladungslampen, sie beinhalten Quecksilber, das wegen des geringen Dampfdrucks auch teilweise gasförmig vorliegt. Fließt durch dieses Gas Strom, wird das Gas ionisiert und Licht entsteht. In der UV-VIS-Spektroskopie hingegen verwendet man Deuterium-Lampen, Wolfram-Halogenlampen oder aber Xenonbogenlampen. Deuteriumlampen sind ebenfalls Gasentladungslampen, mit einem Wolfram-Filament und mit Deuterium als Füllung. Wird Strom angelegt, so findet eine Gasentladung statt und Licht entsteht. Wolfram-Halogenlampen haben auch einen Wolframdraht, der erhitzt wird. Hier leuchtet der Wolframdraht selbst. Bei Wolfram-Halogenlampen setzt man Iod zu, da dies durch Sublimation an den dünnsten Stellen des Drahts die Lebensdauer der Lampe erhöht. Xenonbogenlampen erzeugen intensive Strahlung durch Strom, der im Xenon-Gas zu einer Gasentladung führt.

Analytische Chemie 2

Wie erfolgt die Wellenlängenkalibration für UV-VIS sowie für FTIR-Spektrometer?

Bei UV-VIS Spektrometern werden zur Wellenlängenkalibration feste oder flüssige Standards verwendet. Diese Standards haben ein genaues, eindeutiges Spektrum, das bekannt ist. Auf dieses Spektrum muss das Spektrometer dann kalibriert werden. Bei FTIR-Spektrometern hingegen ist ein HeNe-Laser als „Maßband“ eingebaut, weswegen keine Kalibration notwendig ist.

Analytische Chemie 2

Was sind digitale Filter im Allgemeinen und welche Vorteile besitzen diese im Vergleich zu Hardware-basierenden Filtern zur Verbesserung des Signal-Rausch-Verhältnisses?

Digitale Filter verarbeiten das erhaltene Signal mithilfe von mathematischen Algorithmen. Dazu muss das analoge Signal erst ins Digitale konvertiert werden, und nach dem Filter wieder zurückgewandelt.


Vorteile digitaler Filter sind: 

• Programmierbarkeit, kann also ohne Änderung der Hardware geändert werden 

• Können an einem PC programmiert, getestet und implementiert werden 

• Stabil, also unempfindlich gegenüber Umgebungsfaktoren (z.B. Temperatur)

• Anwendbar für Signale bei sehr niedrigen Frequenzen 

• Adaptierbar, können also an spezifische Gegebenheiten eines Signals angepasst werden.

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gleitender Mittelwert-Filter

Innerhalb eines vordefinierten Fensters wird der Mittelwert aus allen Signalwerten gebildet. Das Fenster wird entlang der sukzessiv, äquidistant anfallenden Daten verschoben.

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Boxcar-Filterung

Jeweils n Datenpunkte werden durch ihren Mittelwert ersetzt. Man erhält so aber insgesamt weniger Datenpunkte.

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Fourier-Filterung

Die Originaldaten werden einer Fourier-Transformation unterzogen. Ein Spektrum wird durch die Überlagerung von Cosinus-Funktionen unterschiedlicher Frequenz und Amplitude angenähert, wobei die Amplituden der Cosinus-Funktionen die Fourier-Koeffizienten darstellen. Nach einer digitalen Filterung wird das Signal über eine Fourier-Rücktransformation zurückgewandelt.

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