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Lernmaterialien für VRL 8/9/10 : Grundprinzipien der Klonierung an der Technische Hochschule Mittelhessen

Greife auf kostenlose Karteikarten, Zusammenfassungen, Übungsaufgaben und Altklausuren für deinen VRL 8/9/10 : Grundprinzipien der Klonierung Kurs an der Technische Hochschule Mittelhessen zu.

TESTE DEIN WISSEN

Welche Möglichkeiten der direkten Selektion des gesuchten Klons gibt es?

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Direkte Selektion des gesuchten Klons
a) 2 Resistenzgene im Plasmid vorhanden Tetrazyklin-Resistenz geht bei erfolgreicher Klonierung verloren, wenn gesuchtes Gen in das Gen hineinligiert wird. (Negativ-Selektion, Stempeltechnik zur Identifikation des Klons nötig)

-> Direkte Selektion des gesuchten Klons
Stempeltechnik: Mit einem sterilen Samtstempel kann das Muster der Kolonienanordnung in der Petrischale auf weitere Schalen übertragen werden.


b) Marker Rescue erweitert die Anwendungmöglichkeiten der direkten Selektion
• Empfänger-Organismus = Mangelmutante, die Defizienz besitzt (Auxotrophie).
• „Hilfsgen“ wird mit dem zu klonierenden Gen
transformiert.
• Selektivnährboden notwendig -> Der im Nährmedium fehlende Stoff ist durch übertragenes Gen komplementierbar (komplementieren = ergänzen).
• ->Neg-Transformanten bzw. nicht transformierte
Organismen bleiben auxotroph -> kein Wachstum
möglich -> nur erfolgreich transformierte Individuen
können Klone bilden.

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Was ist eine Genbibliothek? Vor- und Nachteile

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Genbibliothek, auch Genbank genannt
Genomische Biobliothek – Sammlung von Klonen, deren Zahl so groß ist, dass in ihnen wahrscheinlich jedes Gen eines bestimmten Organismus vorhanden ist.
Erstellung mithilfe der „Schrotschuss“-Klonierung


Vor-/Nachteile:

+ Lagerung und Speicherung von Genomen
− Sehr viele Gene, unübersichtlich
− Auch nicht codierende Sequenzen (Introns, repetitive
Sequenzen, Centromere, Telomere etc.)
− Große Herausforderung, den gesuchten Klon zu finden

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Enzyme in der Gentechnik

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 Nukleasen–schneiden Nukleinsäuremoleküle, verkürzen sie oder bauen sie ab
Ligasen–verknüpfen Nukleinsäuremoleküle
• Polymerasen–stellen Kopien von Nukleinsäuremolekülen her
Modifikationsenzyme–entfernen chemische Gruppen oder fügen sie an
• Topoisomerasen –sorgen dafür, dass in einer kovalent gechlossenen, ringförmigen DNA über-Windungen entstehen oder verschwinden

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Was sind Exonukleasen/Endonukleasen?

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• Exonukleasen
– entfernen ein Nukleotid nach dem anderen von einem DNA-Strang/von Beginn des Strangs
• Endonukleasen
– können Phosphodiesterbindungen im INNEREN eines DNA-Moleküls spalten/ aus der Mitte des Strangs (Restriktionsendonukleasen)

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Wie funktioniert die Nomenklatur der Restriktionsenzyme?

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• 1. Buchstabe (groß) des Gattungsnamen des Bakteriums aus dem das R-Enzym stammt
• 2. und 3. Buchstabe (klein) der Art.
• Erweitert wird durch Namenszusätze und die chronologische Abfolge der Entdeckung
HpaI -> Haemophilus parainfluenzae

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Wozu dienen Ligasen/Ligation in der Gentechnik?

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- Kohäsive Überhänge werden mithilfe der DNA-Ligase miteinander verbunden
- BamHI und BglII produzieren die gleichen Überhänge oder kohäsiven Enden: einen 3´-CTAG-5´und einen 5´-GATC-3´-Überhang.
- Sie sind zueinander komplementär, können H-Brücken und daher Basenpaarungen ausbilden.
(- Die Lücken im DNA-Rückgrat werden durch die T4-Ligase geschlossen.
- Für diese Reaktion wird ATP hydrolysiert.
T4-Ligase stammt aus E. coli-Zellen, die mit T4 infiziert wurden.)


- Ligieren von blunt ends

Das funktioniert auch, ist aber wenig effizient, da die Moleküle in vitro zufällig aufeinandertreffen müssen, damit die Ligase sie zusammenfügen kann.
->hohe DNA-Konzentrationen müssen vorliegen
->dauert viel länger als bei Ligation von „sticky ends“
Möglichkeiten bestehen, um das Problem zu lösen:
– 1. Anfügen von Linkern
– 2. Anfügen von Adaptern
– 3. Anfügen von Homopolymerschwänzen

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Was sind Möglichkeiten zum Ligieren von blunt ends?

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-  mit Ligase: funktioniert, aber wenig effizient


1. Anfügen von Linker-Molekülen
– Was sind Linker?
• Kleine DNA-Stücke bekannter Sequenz in vitro hergestellt, besitzen R-Schnittstelle(n)
• Vorteil: Hohe Konzentrationen des Linkers stehen zur Verfügung und können eingesetzt werden, um von der Ligase angefügt zu werden.

2. Anfügen von Adaptermolekülen

klebrige Enden, die sich untereinander verbinden & durch Ligase verknüpft werden

3. Anfügen von Homopolymeren (tailing)

tailing s, bezeichnet das matrizenunabhängige Anhängen von Desoxyribonucleotiden (2'-Desoxyribonucleosidmonophosphate) an die 3'-Enden von DNA durch das Enzym terminale Transferase. Oft wird bei dem tailing von DNA-Molekülen nur ein Nucleotid angeboten („Homopolymer-tailing“). Tailing kann zum einen zur Markierung der 3'-Enden von DNA durchgeführt werden, wenn man markierte Desoxyribonucleotide einsetzt. Es stellt somit eine Alternative zur normalen Endmarkierung mittels Klenow-Enzym (Klenow-Fragment) dar.

Oftmals sind die Nukleotid-schwänze nicht gleich lang und es entstehen Lücken.
Diese können von der Klenow-Polymerase aufgefüllt werden
Oder
Sie werden nach der Transfor-mation von Wirtszell-eigenen Enzymen aufgefüllt.

Die Klenow-Polymerase wird auch Klenow-Fragment genannt. Es entspricht der Polymerase I aus Escherichia coli OHNE 5'→3' Exonuklease-Aktivität


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Was sind die Anwendungsgebiete von Restriktionsenzymen?

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• Gentech: vorwiegend Klonierungen u. deren Überprüfung u.s.w.
• Genkartierungen, Restriktionsfragmentanalyse
• DNA-Profilanalyse -Identifikation von 
Individuen
– Forensik
– Verwandschaftsverhältnisse
• Klärung stammesgeschichtlicher Verwandtschaften (-> phylogenetischer Stammbaum)
• Methoden
– Restriktionsverdau und verschiedene Elektrophoresearten

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Nenne 3 Restriktionsenzyme

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- Eco RI

- Bam HI

- Taq I

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Was sind Vektoren? Wofür werden sie in der Gentechnik benutzt?

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Vektor-lat.: „Träger Fahrer“, auch „Vehikel“ -> Hilfsmittel
In der Gentechnik: Hilfsmittel zur Einführung genet. (Fremd-)Materials in Zellen z. B. für die Klonierung
– Plasmide
– Bakteriophagen
– BACs, YACs
– Lentivirale Vektoren

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Was sind die Eigenschaften von Plasmiden?

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– Kommen in Bakterien vor
– Genetische Elemente, nicht essentiell
– dsDNA
Replikation unabhängig vom Wirtschromosom
– Normalerweise ringförmig, auch linear möglich
– Weit verbreitet (-> alleine in E. coli hat man 300 natürlich vorkommende Plasmide entdeckt)
– Größe: Kilo -Megabasenpaare ~ 5 % des Chromosoms
Charakt. Kopienanzahl (low copy number, high copy number plasmid)
– Nutzen Enzyme der Zelle für Replikation
– Plasmidgene kontrollieren ihre eigene Replikation und Weitergabe

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Warum eignet sich das Plasmid pBR327 als Sicherheitsplasmid?

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Bsp. pBR322: (Entwicklung in 1970ern)
– eines der ersten in vitro konstruierten Plasmide, von dem sich viele spätere Entwicklungen ableiten
– Weiterentwicklung zu pBR327
• Kopienanzahl /Zelle ist gegenüber pBR322 erhöht
Deletion der konjugativen Mobilisierbarkeit -> kann also nicht horizontal über Konjugation weitergegeben werden -> Sicherheitsplasmid!

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Beispielhafte Karteikarten für deinen VRL 8/9/10 : Grundprinzipien der Klonierung Kurs an der Technische Hochschule Mittelhessen - von Kommilitonen auf StudySmarter erstellt!

Q:

Welche Möglichkeiten der direkten Selektion des gesuchten Klons gibt es?

A:
Direkte Selektion des gesuchten Klons
a) 2 Resistenzgene im Plasmid vorhanden Tetrazyklin-Resistenz geht bei erfolgreicher Klonierung verloren, wenn gesuchtes Gen in das Gen hineinligiert wird. (Negativ-Selektion, Stempeltechnik zur Identifikation des Klons nötig)

-> Direkte Selektion des gesuchten Klons
Stempeltechnik: Mit einem sterilen Samtstempel kann das Muster der Kolonienanordnung in der Petrischale auf weitere Schalen übertragen werden.


b) Marker Rescue erweitert die Anwendungmöglichkeiten der direkten Selektion
• Empfänger-Organismus = Mangelmutante, die Defizienz besitzt (Auxotrophie).
• „Hilfsgen“ wird mit dem zu klonierenden Gen
transformiert.
• Selektivnährboden notwendig -> Der im Nährmedium fehlende Stoff ist durch übertragenes Gen komplementierbar (komplementieren = ergänzen).
• ->Neg-Transformanten bzw. nicht transformierte
Organismen bleiben auxotroph -> kein Wachstum
möglich -> nur erfolgreich transformierte Individuen
können Klone bilden.

Q:

Was ist eine Genbibliothek? Vor- und Nachteile

A:

Genbibliothek, auch Genbank genannt
Genomische Biobliothek – Sammlung von Klonen, deren Zahl so groß ist, dass in ihnen wahrscheinlich jedes Gen eines bestimmten Organismus vorhanden ist.
Erstellung mithilfe der „Schrotschuss“-Klonierung


Vor-/Nachteile:

+ Lagerung und Speicherung von Genomen
− Sehr viele Gene, unübersichtlich
− Auch nicht codierende Sequenzen (Introns, repetitive
Sequenzen, Centromere, Telomere etc.)
− Große Herausforderung, den gesuchten Klon zu finden

Q:

Enzyme in der Gentechnik

A:

 Nukleasen–schneiden Nukleinsäuremoleküle, verkürzen sie oder bauen sie ab
Ligasen–verknüpfen Nukleinsäuremoleküle
• Polymerasen–stellen Kopien von Nukleinsäuremolekülen her
Modifikationsenzyme–entfernen chemische Gruppen oder fügen sie an
• Topoisomerasen –sorgen dafür, dass in einer kovalent gechlossenen, ringförmigen DNA über-Windungen entstehen oder verschwinden

Q:

Was sind Exonukleasen/Endonukleasen?

A:

• Exonukleasen
– entfernen ein Nukleotid nach dem anderen von einem DNA-Strang/von Beginn des Strangs
• Endonukleasen
– können Phosphodiesterbindungen im INNEREN eines DNA-Moleküls spalten/ aus der Mitte des Strangs (Restriktionsendonukleasen)

Q:

Wie funktioniert die Nomenklatur der Restriktionsenzyme?

A:

• 1. Buchstabe (groß) des Gattungsnamen des Bakteriums aus dem das R-Enzym stammt
• 2. und 3. Buchstabe (klein) der Art.
• Erweitert wird durch Namenszusätze und die chronologische Abfolge der Entdeckung
HpaI -> Haemophilus parainfluenzae

Mehr Karteikarten anzeigen
Q:

Wozu dienen Ligasen/Ligation in der Gentechnik?

A:

- Kohäsive Überhänge werden mithilfe der DNA-Ligase miteinander verbunden
- BamHI und BglII produzieren die gleichen Überhänge oder kohäsiven Enden: einen 3´-CTAG-5´und einen 5´-GATC-3´-Überhang.
- Sie sind zueinander komplementär, können H-Brücken und daher Basenpaarungen ausbilden.
(- Die Lücken im DNA-Rückgrat werden durch die T4-Ligase geschlossen.
- Für diese Reaktion wird ATP hydrolysiert.
T4-Ligase stammt aus E. coli-Zellen, die mit T4 infiziert wurden.)


- Ligieren von blunt ends

Das funktioniert auch, ist aber wenig effizient, da die Moleküle in vitro zufällig aufeinandertreffen müssen, damit die Ligase sie zusammenfügen kann.
->hohe DNA-Konzentrationen müssen vorliegen
->dauert viel länger als bei Ligation von „sticky ends“
Möglichkeiten bestehen, um das Problem zu lösen:
– 1. Anfügen von Linkern
– 2. Anfügen von Adaptern
– 3. Anfügen von Homopolymerschwänzen

Q:

Was sind Möglichkeiten zum Ligieren von blunt ends?

A:

-  mit Ligase: funktioniert, aber wenig effizient


1. Anfügen von Linker-Molekülen
– Was sind Linker?
• Kleine DNA-Stücke bekannter Sequenz in vitro hergestellt, besitzen R-Schnittstelle(n)
• Vorteil: Hohe Konzentrationen des Linkers stehen zur Verfügung und können eingesetzt werden, um von der Ligase angefügt zu werden.

2. Anfügen von Adaptermolekülen

klebrige Enden, die sich untereinander verbinden & durch Ligase verknüpft werden

3. Anfügen von Homopolymeren (tailing)

tailing s, bezeichnet das matrizenunabhängige Anhängen von Desoxyribonucleotiden (2'-Desoxyribonucleosidmonophosphate) an die 3'-Enden von DNA durch das Enzym terminale Transferase. Oft wird bei dem tailing von DNA-Molekülen nur ein Nucleotid angeboten („Homopolymer-tailing“). Tailing kann zum einen zur Markierung der 3'-Enden von DNA durchgeführt werden, wenn man markierte Desoxyribonucleotide einsetzt. Es stellt somit eine Alternative zur normalen Endmarkierung mittels Klenow-Enzym (Klenow-Fragment) dar.

Oftmals sind die Nukleotid-schwänze nicht gleich lang und es entstehen Lücken.
Diese können von der Klenow-Polymerase aufgefüllt werden
Oder
Sie werden nach der Transfor-mation von Wirtszell-eigenen Enzymen aufgefüllt.

Die Klenow-Polymerase wird auch Klenow-Fragment genannt. Es entspricht der Polymerase I aus Escherichia coli OHNE 5'→3' Exonuklease-Aktivität


Q:

Was sind die Anwendungsgebiete von Restriktionsenzymen?

A:

• Gentech: vorwiegend Klonierungen u. deren Überprüfung u.s.w.
• Genkartierungen, Restriktionsfragmentanalyse
• DNA-Profilanalyse -Identifikation von 
Individuen
– Forensik
– Verwandschaftsverhältnisse
• Klärung stammesgeschichtlicher Verwandtschaften (-> phylogenetischer Stammbaum)
• Methoden
– Restriktionsverdau und verschiedene Elektrophoresearten

Q:

Nenne 3 Restriktionsenzyme

A:

- Eco RI

- Bam HI

- Taq I

Q:

Was sind Vektoren? Wofür werden sie in der Gentechnik benutzt?

A:

Vektor-lat.: „Träger Fahrer“, auch „Vehikel“ -> Hilfsmittel
In der Gentechnik: Hilfsmittel zur Einführung genet. (Fremd-)Materials in Zellen z. B. für die Klonierung
– Plasmide
– Bakteriophagen
– BACs, YACs
– Lentivirale Vektoren

Q:

Was sind die Eigenschaften von Plasmiden?

A:

– Kommen in Bakterien vor
– Genetische Elemente, nicht essentiell
– dsDNA
Replikation unabhängig vom Wirtschromosom
– Normalerweise ringförmig, auch linear möglich
– Weit verbreitet (-> alleine in E. coli hat man 300 natürlich vorkommende Plasmide entdeckt)
– Größe: Kilo -Megabasenpaare ~ 5 % des Chromosoms
Charakt. Kopienanzahl (low copy number, high copy number plasmid)
– Nutzen Enzyme der Zelle für Replikation
– Plasmidgene kontrollieren ihre eigene Replikation und Weitergabe

Q:

Warum eignet sich das Plasmid pBR327 als Sicherheitsplasmid?

A:

Bsp. pBR322: (Entwicklung in 1970ern)
– eines der ersten in vitro konstruierten Plasmide, von dem sich viele spätere Entwicklungen ableiten
– Weiterentwicklung zu pBR327
• Kopienanzahl /Zelle ist gegenüber pBR322 erhöht
Deletion der konjugativen Mobilisierbarkeit -> kann also nicht horizontal über Konjugation weitergegeben werden -> Sicherheitsplasmid!

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