Greife auf kostenlose Karteikarten, Zusammenfassungen, Übungsaufgaben und Altklausuren für deinen Molekularbiologische Methoden Kurs an der Leibniz Universität Hannover zu.
255322
Karteikarten
3904
Studierende
167
Lernmaterialien
Worin müssen Start-und Stop Codon immer sein?
Exon
Wie steht es um die Wasserstoffbrückenbindungen in der DNA?
AT - 2fachbindung
GC - 3fachbindung
Mit dem Gehalt der GC-Bindungen steigt/sinkt die Schmelztemperatur?
steigt
Nukleotid
Was macht die Quartärstruktur?
Interaktion zwischen Peptiden
Purin paart immer ein
Pyrimidin
Aufbau der DNA
-> drei Wasserstoffbrücken
-> zwei Wasserstoffbrücken
Prinzipien biologischer Systeme
Reinstwasser
Nukleoside
Codon Usage
-> je weniger verwandt die Organismen, desto größer die Unterschiede
-> Ursache: t-RNAs mit verschiedenen Anticodons für gleiche AS unterschiedlich häufig
-> Im heterologen Expressionssystem: Tanslationsabbruch möglich
Deoxyribose hat an diesem Atom ein Wasserstoffatom, während RNA an dieser Position eine Hydroxylgruppe hat
Kohlenstoffatom C2
Greife kostenlos auf tausende geteilte Karteikarten, Zusammenfassungen, Altklausuren und mehr zu.
Jetzt loslegen1. Schockgefrieren in flüssigem Stickstoff und pulverisieren (bei Gewebe)
2. Aufschluss der Zellen/Gewebe, dabei Inaktivierung von Proteinen
Art der Homogenisation hängt ab von:
Art des Probenmaterials Der zu isolierenden Probenmenge Probenzahl
- Zellwand - Milligramm oder Kilogramm
- Fasern
- Gehalt Sekundärstoffe
Gängige Pufferkomponenten
SDS
Zerstörung der Plasmamembran
EDTA
reduziert Aktivität von DNasen
DTT/ß-Mercaptoethanol
schaffen reduzierende Umgebung -> beugen oxidativen Schädigungen der DNA während Homogenisation vor
Proteinase K
baut Proteine sehr effizient ab
Vorteil: bei 65° noch aktiv
GTC
chaotropes Salz
denaturiert Proteine, auch DNasen und RNasen, und lysiert gleichzeitig die Zellen
CTAB
sorgt für Entfernung von Polysacchariden (reichhaltig in Pflanzen)
effizientes Mittel, um Proteine zu denaturieren
Hohe Ionenstärke: Bildet Komplex mit Proteinen und neutralen Polysacchariden, DNA bleibt in Lösung
Niedrige Ionenstärke: Fällt Nukleinsäuren und saure Polysaccharide
PVP
Akzeptor für reaktive, oxidierte Polyphenole
3. Abtrennung der Nukleinsäuren von anderen Zellbestandteilen
Nach dem Aufschluss und der Inaktivierung der Nukleasen erfolgt meist eine Zentrifugation bei 4°C, bei der die Nukleinsäuren im Überstand von Zelltrümmern und Fasern abgetrennt werden.
DNA befindet sich nun mit Proteinen, Lipiden, etc. im Überstand.
Phenolextraktion ( "PCI")
25 Teile Phenol (basisches Phenol für DNA Aufreinigung, saures Phenol für RNA Aufreinigung)
24 Teile Chloroform
1 Teil Isoamylalkohol (Schaumhemmer)
|
PCI-Mischung wird der DNA Lösung im Überschuss zugegeben
DNA und RNA: obere wässrige Phase
Proteine: denaturiert auf unterer organischen Phase
Lipide: gelöst in Organischer Phase
Funktion: - Aufreinigung der DNA
- Reduktion des Volumens, in dem die DNA gelöst ist (Konzentration)
4. Trennung von RNA und DNA
Erfolgt durch Enzyme:
DNase freie RNase um DNA aufzureinigen
RNase freie DNase um RNA aufzureinigen
5. Konzentrierung und Umpuffern
Ethanolfällung:
3 Effekte
- unerwünschte Stoffe in der DNA-Lösung werden entfernt
- DNA wird konzentriert
- sedimentierte DNA kann auf diese Weise in einen neuen Puffer überführt werden
|
oder
Isopropanolfällung:
Verwendete Salze und ihre Eigenschaften
| Salz | Stammlösung | Arbeitslösung | Bemerkung |
| Ammoniumacetat | 10 M | 2-2,5 M | Häufig verwendet, dNTPs und Oligonukleotide werden abgetrennt; Gut geeignet nach ß-Agarase-Abbau von Gelen; Sollte vermieden werden, wenn nachfolgend T4 Polynukleotidkinase eingesetzt wird |
| Lithiumchlorid | 8 M | 0,8 M | Für Fällung von RNA > 300 Basen, dsDNA wird nicht gefällt |
| Natriumchlorid | 5 M | 0,2 M | Wenn SDS verwendet wird → SDS verbleibt im Überstand |
| Natriumacetat | 3 M (pH 5,2) | 0,3 M | Sehr häufig für DNA und RNA verwendet, universell einsetzbar |
Silica Matrices ("Kits")
Zentrale Komponente: Silicasäulchen, -membranen, oder -kügelchen
|
Unterschiede in verschiedenen Kits
- Beschaffenheit der Silica-Matrix
- Kapazität
- Adsorptionsstärke
- verwendete chaotrope Ionen
| Funktioniert nur im basischen. Kein Reinstwasser, da zu sauer! |
Das Prinzip von Silica-basierten Aufreinigungsverfahren beruht auf der Bindung der DNA an eine Silica-Matrix in Gegenwart von chaotropen Salzen (A und A1). Die Proteine und kleine Nukleinsäuren bis zu einer Länge von ca. 70 bp binden nicht und werden mit Ethanol und Salz ausgewaschen (B). H2O oder TE-Puffer (C) stellen die Hydrathülle der DNA wieder her, sie wird eluiert (C1).Tipps zum Umgang mit Kits
- möglichst wenig Elutionspuffer
- Enthält Elutionspuffer EDTA? → Obacht bei folgenden Enzymreaktionen
- nicht mit H2O eluieren, sondern niedrig konzentriertem Tris-Puffer (pH > 7)
- nach Silika-Säule keine OD-Bestimmung → keine Photometermessung sondern Gel
- Nie Komponenten aus verschiedenen Kits zusammen verwenden
Plasmidpräperation aus E. coli
→ Lösung I: Tris, EDTA + RNase (TE-Puffer); Waschen der Bakterien, Medium auswaschen (Substanzen die Stören)
→ Lösung II: SDS, NaOH (Lauge, denaturiert Proteine); Lysis und Stränge gehen auseinander
| Hiernach nur Kippen, nicht Vortexen! Da sonst die schon recht kaputten Bakterienzellen zerreißen und gDNA nach Draußen treten könnte |
→ Lösung III: Na-Acetat; für neutralen pH, Plasmide renaturieren, Reste der Zellwand halten gDNA drinnen, gDNA drinnen und Plasmid-DNA draußen
5. Zentrifugieren → alles Pelletieren, Plasmid-DNA im Überstand
Der Überstand mit den Plasmiden wird vorsichtig in ein neues Gefäß überführt und es wird eine klassische Ethanolfällung durchgeführt
Gegenspieler erfolgreicher Nukleinsäure-Extraktionen
Melde dich kostenlos an und bekomme Zugang zu der kompletten Zusammenfassung und tausenden Karteikarten!
