LM-Analytik, biochemische und biologische Methoden at Karlsruher Institut für Technologie

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Was ist Bioanalytik?
Was sind biochemische und biologische Methoden in der Lebensmittelanalytik?

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Was sind immunologische Methoden?
Welche gibt es und was sind die vor- und Nachteile?

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Was sind Antikörper?

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Welche Arten von Antigen-Antikörper-Reaktionen gibt es?

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Wovon sind Spezifität/Avidität/Affinität eines Antikörpers abhängig?

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Wie wird die sichtbare Folge einer Immunreaktion bezeichnet?

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Gewinnung von Antisera/Antikörper zum Nachweis von Proteinen in Lebensmitteln?

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Was sind mono-/polyklonale Antikörper?

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Beispiele für Immunoassays mit Tracern?

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Was sind Immunoassays?

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Was sind RIA?

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Radioimmunoassay in Lösung?

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LM-Analytik, biochemische und biologische Methoden

Was ist Bioanalytik?
Was sind biochemische und biologische Methoden in der Lebensmittelanalytik?
Analyse von Biomolekülen (v.a. Proteine, RNA, DNA; weniger Lipide und Kohlenhydrate)

- herausragende Bedeutung für Biochemie und Medizin, zunehmende Bedeutung für Analyse von LM


Biochemische und biologische Methoden in der LM-analytik:
- immunologische Methoden
- Elektrophoretische Methoden
- PCR
- Zellkulturen

LM-Analytik, biochemische und biologische Methoden

Was sind immunologische Methoden?
Welche gibt es und was sind die vor- und Nachteile?
- beruhen auf Einsatz von Antikörpern  und den von ihnen vermittelten Reaktionen (Antigen-Antikörper-Komplexe)

Einsatzgebiete:
- Immunopräzipitation (2D-Immundiffusion nach Ouchterlony)
- Immuniassays (ELISA, RIA)
- Immunoblotting
- immunoelektrophoretische Methoden

Vorteile:
- hohe Spezifität
- viele Einsatzmöglichkeiten

Nachteile:
- komplexe Gewinnung (teuer!)
- teilweise komplizierte Handhabung

LM-Analytik, biochemische und biologische Methoden

Was sind Antikörper?
- zentrale Bestandteile des Immunsystems von Wirbeltieren
- Glycoproteine, die v.a. Zur Abwehr von Mikroorganismen und Viren dienen und reversibel und spezifisch an ein Antigen binden
- Antigenbindungsstelle = Paratop, hypervariable Regionen
- unterscheiden körpereigene und -fremde Substanzen zur Eliminierung nicht körpereigener Substanzen
- werden in 5 Antikörperklassen eingeteilt:
* Immunoglobulin A (IgA)
* Immunoglobulin D (IgD)
* Immunoglobulin E (IgE)
* Immunoglobulin G (IgG)
* Immunoglobulin M (IgM)

IgG​ ist wichtigster analytischer Antikörper in der Immunchemie!​​​

LM-Analytik, biochemische und biologische Methoden

Welche Arten von Antigen-Antikörper-Reaktionen gibt es?
- stereochemische Komplementarität
- H-Brücken
- Ionenbindungen
- vdW-Kräfte
- hydrophobe WW

LM-Analytik, biochemische und biologische Methoden

Wovon sind Spezifität/Avidität/Affinität eines Antikörpers abhängig?
- Spezifität eines Antikörpers ist abhängig von der Bindungsstärke (Avidität) zum Antigen
Avidität ist u.a. Abhängig von der Affinität 
-  Affinität ist abhängig von der Bindungsstärke aller suballele (?)
homologe Antigene (verwendete Immunogene) besitzen stärkste Affinität, idR geringere Affinität haben kreuzreagierende Antigene (heterologe Antigene), die mit den Immunogenen nicht identisch, sondern nur chemisch verwandt sind

LM-Analytik, biochemische und biologische Methoden

Wie wird die sichtbare Folge einer Immunreaktion bezeichnet?
Je nach Art des Antigens: Agglutination, Präzipitation ​ oder Immunbindung​​​

LM-Analytik, biochemische und biologische Methoden

Gewinnung von Antisera/Antikörper zum Nachweis von Proteinen in Lebensmitteln?
- Antisera werden meist gewonnen durch Immunisierung von Kaninchen mit Protein-Präparaten des Handels (zB Casein oder Enzympräparate wie Papain) -> Spektrum von Antikörpern gegen verschiedene Proteine -> oligo- bzw polyspezifisches Antiserum

- nur in Ausnahmefällen Immunisierung mit hoch gereinigten Proteinen, sodass monospezifisches Antiserum bei Immunisierung erhalten wird (zB Haselnuss-Corylin ) -> liefert bei Präzipitationstechniken nur eine Präzipitatbande

-

LM-Analytik, biochemische und biologische Methoden

Was sind mono-/polyklonale Antikörper?
Gewinnung von Antisera durch Immunisierung von Kaninchen mit Proteinpräparaten oder synthetischen Peptiden (auf Träger)

->
polyklonale Antikörper:
- Antikörper gegen ein Antigen, die viele verschiedene Isotypen mit unterschiedlicher Affinität zu verschiedenen Epitopen repräsentieren
- werden von vielen Zellklonen gebildet

monoklonale Antikörper:
- Antikörper chemisch einheitlicher Struktur, die mit nur einem Epitop auf dem Antigen reagieren
- Gewinnung durch immortalisierte, isolierte B-Zellen
- Rekombinante Gewinnung von Antikörper-Fragmenten

LM-Analytik, biochemische und biologische Methoden

Beispiele für Immunoassays mit Tracern?
- L00.00-69 Bestimmung von ​Erdnuss-Kontamination​ in Lebensmitteln mittels ELISA Mikrotiterplattensystem​​​

- L 01.00-67 Screeningverfahren auf Sulfadimidin​-Rückstände in Milch mit ELISA im Mikrotitersystem
- L 01.01-4 Bestimmung von Chloranphenicol​-Rückständen in Milch, Screening mit RIA
- L 02.07-08 Aflatoxin M1 in Milchpulver, Screening mit ELISA
- L 06.00-53  Gewebe des ZNS​ durch Nachweis des sauren Gliafaserproteins in Fleisch und Fleischerzeugnissen, enzymimmunologisch
- L 06.00-47 Nachweis der Tierart​ bei erhitztem Fleisch und Fleischerzeugnissen, enzymimmunologisch

LM-Analytik, biochemische und biologische Methoden

Was sind Immunoassays?
Kennzeichen:
- Bindung eines spezifischen Atoms oder Moleküls (“Marker“, “Label“ oder “Tracer“) an den Antikörper oder an das Antigen
- meist an Festphasen, nur noch selten in Lösung (siehe RIA)

Verschiedene Konzepte:
- kompetitiver Assay
- Sandwich-/nicht kompetitiver Assay 
- direkter Assay (nur noch selten)

Verschiedene Tracer:
- Radioisotope (heute nur noch selten) -> RIA (RadioImmunoAssay)
- Enzyme (Folgereaktionen) -> ELISA
- fluoreszierende oder lumineszierende Moleküle

LM-Analytik, biochemische und biologische Methoden

Was sind RIA?
Radioimmunoassays
- Immunreaktion mit anschließender Messung der Radioaktivität
- RIA in Lösung vs Festphasen-RIA
- beide Varianten werden als kompetitiver Assay durchgeführt:
+ radiomarkierte (“heiße“) Antigene konkurrieren mit unmarkierten (“kalten“) Antigenen
+ Radiomarkierung durch einführen von 125I oder 3H 
+ Messung der Radioaktivität mithilfe eines Szintillationsdetektors

LM-Analytik, biochemische und biologische Methoden

Radioimmunoassay in Lösung?
- Zusatz einer bestimmten Menge radiomarkierten Antigens zu einer Probenlösung
- Zusatz definierter Menge eines Antiserums
-> Bildung löslicher Immunkomplexe (meist keine Präzipitation)

Vor der Radioaktivitätsmessung:
Trennung gebundener Immunkomplexe und freier heißer Antigene nötig:
- Komplex ausfällen, Antigen muss gelöst bleiben; möglich zB in 35-50%iger Ammoniumsulfatlösung 
Oder
- Adsorption des Immunkomplexes an Betonit oder Aktivkohle

-> Messung der Radioaktivität in einer der beiden “Phasen“
-> Berechnung des kalten Antigens über eine Kalibrierkurve mit unterschiedlichen Zusätzen an kaltem Antigen

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