LM-Analytik, biochemische und biologische Methoden at Karlsruher Institut für Technologie

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Was ist ein Template? Wie erhält man es?

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Was ist PCR?

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Elektrophoretische Trennung von Proteinen?

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Glutamin in Zellkulturmedien?

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Beispiel für ein Radioimmunoassay?

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Isoelektrische Fokussierung?

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Kohlenhydrate und AS in Zellkulturmedien?

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Puffersysteme für die Elektrophorese?

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Vor- und Nachteile eines Radioimmunoassays?

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Was ist die “hot start“ PCR?

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Was sind RIA?

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Probenvorbereitung bei der Gelelektrophorese?

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LM-Analytik, biochemische und biologische Methoden

Was ist ein Template? Wie erhält man es?
– ist immer DNA (genomische DNA, Plasmide, virale DNA)
– bei Untersuchung von RNA zuvor Umschreibung in cDNA (copy DNA) mittels “Reverser Transkriptase“ (RT-PCR)
– Probenaufarbeitung:
+ Isolierung der DNA aus biologischem Material
+ Abtrennung von störenden Bestandteilen wie Proteinen, Fetten und Inhibitoren (zB Hämoglobin-Abbauprodukte in Blut)
+ Bestimmung von DNA-Gehalt und Reinheit

LM-Analytik, biochemische und biologische Methoden

Was ist PCR?
Polymerase Chain Reaction:
-> in vitro Reproduktion von DNA-Segmenten 
– Amplifikation von DNA-Segmenten
– 1987 erstmals beschrieben von Kary B. Mullis
– kein Nachweisverfahren an sich, wird in unterschiedliche Nachweismethoden und Verfahrensabläufe integriert
– wichtige Schritte vor der PCR sind zb Nucleinsäureisolierung und Abtrennung möglicher PCR-Inhibitoren 
– Nach der PCR: zb Elektrophorese, Hybridisierung etc. gekoppelt mit qualitativen oder quantitativen Nachweisverfahren statt

LM-Analytik, biochemische und biologische Methoden

Elektrophoretische Trennung von Proteinen?
Probenvorbereitung, Trennprinzip und Detektion können je nach Fragestellung verschiedenartig variiert werden:
Probenvorbereitung:
– nativ
– (partiell) denaturierend
Trennprinzip:
– Isotachophorese
– Zonenelektrophorese
– isoelektrische Fokussierung
– Porengradienten-Elektrophorese (eher selten)
Detektion:
– spezifisch
– unspezifisch

LM-Analytik, biochemische und biologische Methoden

Glutamin in Zellkulturmedien?
– in hörten Konzentrationen (2-4 mM) verwendet
– Aminosäure und Energiequelle
– Endprodukt des Glutaminstoffwechsels ist Ammoniak
– instabil in wässrigen Lösungen
– Ersatz: glutaminhaltige Dipeptide 
-> werden durch intrazelluläre Peptidasen gespalten (stabiles “Depot“)
-> nicht für alle Zellen geeignet, da sie zu Wachstumsverzögerungen führen können 

LM-Analytik, biochemische und biologische Methoden

Beispiel für ein Radioimmunoassay?
Chloramphenicol-Rückstände in Milch
– 3H-markierter Standard (Antigen)
– Ausfällung des Immunokomplexes mittels Aktivkohle
– Messung der Radioaktivität des Überstandes nach Zentrifugation
– Nachweise von Chloramphenicol-Rückständen in Milch im Bereich von 1μg/kg möglich

LM-Analytik, biochemische und biologische Methoden

Isoelektrische Fokussierung?
– erlaubt Trennung von Ampholyten wie Proteinen aufgrund unterschiedlicher isoelektrischer Punkte
– Prinzip: Proteine besitzen pH-abhängige Nettoladung (Summe aller positiven und negativen Ladungen an den AS-Seitengruppen)
– Proteine wandern im elektrischen Feld bis zum pH-Wert, der ihrem pI entspricht
– Proteine werden im Gel fokussiert (Diffusion in andere pH-Zonen erzeugt Mobilität und Wanderung zurück in den pH-Bereich des pI)
– isoelektrischer Punkt: Ladung= 0, Mobilität = 0

LM-Analytik, biochemische und biologische Methoden

Kohlenhydrate und AS in Zellkulturmedien?
Glucose: Energiequelle
– physiologische Konzentration: 1g/l (= 5,5 mM)
– High-Glucose-Varianten: 4,5 g/l (= 25 mM)
Fructose und Galactose:
– langsame Verstoffwechselung, geringe Lactat-Akkumulation und damit Veränderung des pH
Aminosäuren:
Von 20 natürlich vorkommenden AS sind 13 für kultivierte Zellen essentiell

LM-Analytik, biochemische und biologische Methoden

Puffersysteme für die Elektrophorese?
– je nach Trennprinzip/Methode unterschiedlich bezüglich:
+ pH
+ Ionenstärke 
+ Pufferkomponenten
+ Zusatz denaturierender Agenzien
– häufig verwendet:
+ Tris-HCl oder Tris-Glycin bei pH-Werten von ca. 7-9
+ für bestimmte Anwendungen: Tris-Barbiturat oder Tris-Tricin
+ für basische Proteine: zb Glycinacetat vei pH = 3,1 -> Proteine laufen in Richtung Kathode!

LM-Analytik, biochemische und biologische Methoden

Vor- und Nachteile eines Radioimmunoassays?
Vorteile:
– sehr empfindlich, Antigene im Bereich von 0,5 pg/ml können bestimmt werden
-> Hauptanwendungsgebiet bei LM war/ ist Nachweis von Hormonen und Tierarzneimitteln 
Nachteile:
– stark begrenzte Lagerungsfähigkeit der heißen Antigene durch Halbwertszeit der Nucleotide 
– geeignete, den Auflagen für den Umgang mit radioaktivem Material entsprechende, Laboreinrichtung nötig
– Kosten für Schutz des Personals
– Beseitigung radioaktiven Abfalls
-> RIA wurde weitgehend von Enzymimmunoassays (ELISA) verdrängt 

LM-Analytik, biochemische und biologische Methoden

Was ist die “hot start“ PCR?
– Taq-Polymerase ist bereits bei RT aktiv
+ häufig Verlängerung von unspezifisch angelagerten Primern oder von Primer-Dimeren
-> Bildung unspezifischer Nebenprodukte
– Abhilfe: “hot start“
Enzymatische Aktivität der Taq-Polymerase ist erst gegeben, wenn erhöhte Temperatur erreicht ist
+ manuell: Taq-Polymerase oder Primer werden erst nach Aufheizphase zum Ansatz gegeben
+ Einsatz von monoklonalen Antikörpern gegen die Taq-Polymerase, die bei hoher T denaturieren und Enzymaktivität frei geben
+ chemisch modifizierte Taq-Polymerase (HotStartTaq), die in inaktiver Vorstufe vorliegt und erst bei hoher Temperatur aktiviert wird 

LM-Analytik, biochemische und biologische Methoden

Was sind RIA?
Radioimmunoassays
– Immunreaktion mit anschließender Messung der Radioaktivität
– RIA in Lösung vs Festphasen-RIA
– beide Varianten werden als kompetitiver Assay durchgeführt:
+ radiomarkierte (“heiße“) Antigene konkurrieren mit unmarkierten (“kalten“) Antigenen
+ Radiomarkierung durch einführen von 125I oder 3H 
+ Messung der Radioaktivität mithilfe eines Szintillationsdetektors

LM-Analytik, biochemische und biologische Methoden

Probenvorbereitung bei der Gelelektrophorese?
– meist vorherige Bestimmung der ungefähren Analytkonzentration :
DNA, Proteine: Photometrisch mittels Nanodrop (Bestimmung der Absorption bei 280/254 nm)
– Proteine: Bradford- oder Lowry-Test
Anschließend:
– verdünnen der Proben in Ladepuffer (genaue Zusammensetzung abhängig von der Anwendung)
Ich enthalten:
+ Glycerin (beschwert die Probe -> Absinken in Probentasche)
+ Bromphenolblau (pH-Indikator, Lauffrontmarker)

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