Zellkultur at Hochschule Weihenstephan-Triesdorf
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Was bedeutet Konfluenz?
Wachstumsfläche auf dem Boden der Kulturflasche in %
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Was sind sie Arbeitsschritte beim Passagieren mit Trypsin?
1. Zellen unter dem Mikroskop kontrollieren
2. Trypsin auf 37°C vorwärmen
3. Medium von Zellen herunternehmen und Zellen mit PBS (RT) waschen
4. Zellen mit Trypsinlösung überschichten und 3-10 min einwirken (bei 4°C, RT, 37°C,
je nach Zelltyp)
5. Ablösen der Zellen unter dem Mikroskop kontrollieren
=> mind. 90% der Zellen sollten beginnen sich abzurunden bzw. abzuschwimmen
6. mittels Pipette die Zellsuspension resuspendieren (´tritorieren`) und in ein
Zentrifugenröhrchen mit mind. doppeltem Volumen Medium (+10% Serum oder
Trypsininhibitor) überführen und mischen.
Optional:
- Abzentrifugieren der Zellen (300 x g)
- Überstand abnehmen
- Zellpellet in frischem Medium resuspendieren
7. Zellen aussäen (nach vorgegebener Zellzahl oder nach Verdünnungsfaktor)
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Was ist Trypsin, warum mischt man es mit EDTA/EGTA beim Passagieren und was muss beim Passagieren beachtet werden ?
Eine Protease, die die Zell-Matrix-Kontakte verdaut. "Detachment"
Abstoppen der Reaktion mit Serum/Medium erforderlich, damit Oberflächenproteine nicht gespalten werden.
EDTA löst Zell-Zell-Kontakte.
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Welche Methoden gibt es noch zum Passagieren von adhärenten Zellkulturen?
- Shake-off
- Abschaben
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Wie funktioniert das Shake-off-Verfahren?
- Abklopfen
- Abspülen
- innerhalb von 30 min. wiederholen, um Ausbeute zu steigern
!Nur Zellen, die locker an Substrat gebunden sind
ODER
Zellen in Mitose
=> Zellen wachsen synchron
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Was ist der Vorteil und der Nachteil beim Passagieren durch Abschaben?
+ Zellmembranen bleiben unverdaut
- einige Zellen werden mechanisch geschädigt
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Was gehört zur Ausstattung des Sterilbereiches?
- Sterile Werkbank mit Arbeitsmaterial
- CO2-Inkubator
- Invertmikroskop mit Phasenkontrast
- Kühlzentrifuge
- Wasserbad
- Schränke
- Kühl/-Gefrierschrank
- Abfallentsorgung
- Waschbecken
- Verbrauchsmaterial
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Ausstattung der Sicherheitswerkbank und Zubehör?
- Vakuumanschluss in der Werkbank und
Vakuumpumpe außerhalb der Werkbank - Arbeitsplatte aus Edelstahl,
Auffangbecken - Beleuchtung
- UV-Lampe
(bei 30-50 cm Reichweite zur Keimabtötung) - Pipettierhilfen
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Nenne ein paar wichtige Verhaltensregeln bei Arbeiten an der Sterilbank
- Werkbank vor und nach der Arbeit 10 min laufen lassen
- Vor Arbeitsbeginn und danach mit 80% Alkohol reinigen
- Nur sterile Sachen in die Werkbank bringen
- Nicht über offene Schalen und Flaschen hantieren
- Werkbank nicht zu voll stellen
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Auf welche 2 Arten kann Temperatur geregelt werden in CO2-Inkubator? Vorteile/Nachteile
- Temperaturregelung mit Wassermantel
- hohe Temperaturkonstanz aber langsame Anpassung bei Veränderung
- Temperaturregulung über Luftmantel-Inkubatoren
- schnelle Temperaturerholung, aber schlechte Konstanz
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Warum braucht man ein CO2-Inkubator?
- alle zelluläre Prozesse sind temperaturabhängig
- Enzyme haben ein Temperaturoptimum
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Welche 2 Materialien eigenen sich als Innenauskleidung bei CO2-Inkubator? Vorteile/Nachteile
- Aus Kupfer (Reinigung alle 6 Wochen)
- Vorteil: Kupfer wirkt bakteriostatisch und fungizid
- Nachteil: teuer
- Edelstahl (Reinigung alle 2 Wochen)
- Vorteil: günstiger
- Nachteil: pflegeintensiver, da Edelstahl Substrat für Kontaminationen
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