Zellkultur at Hochschule Weihenstephan-Triesdorf

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Was bedeutet Konfluenz?

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Was sind sie Arbeitsschritte beim Passagieren mit Trypsin?

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Was ist Trypsin, warum mischt man es mit EDTA/EGTA beim Passagieren und was muss beim Passagieren beachtet werden ?

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Welche Methoden gibt es noch zum Passagieren von adhärenten Zellkulturen?

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Wie funktioniert das Shake-off-Verfahren?

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Was ist der Vorteil und der Nachteil beim Passagieren durch Abschaben?

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Was gehört zur Ausstattung des Sterilbereiches?

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Ausstattung der Sicherheitswerkbank und Zubehör?

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Nenne ein paar wichtige Verhaltensregeln bei Arbeiten an der Sterilbank

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Auf welche 2 Arten kann Temperatur geregelt werden in CO2-Inkubator? Vorteile/Nachteile

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Warum braucht man ein CO2-Inkubator?

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Welche 2 Materialien eigenen sich als Innenauskleidung bei CO2-Inkubator? Vorteile/Nachteile

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Zellkultur

Was bedeutet Konfluenz?

Wachstumsfläche auf dem Boden der Kulturflasche in %

Zellkultur

Was sind sie Arbeitsschritte beim Passagieren mit Trypsin?

1. Zellen unter dem Mikroskop kontrollieren
2. Trypsin auf 37°C vorwärmen
3. Medium von Zellen herunternehmen und Zellen mit PBS (RT) waschen
4. Zellen mit Trypsinlösung überschichten und 3-10 min einwirken (bei 4°C, RT, 37°C,
je nach Zelltyp)
5. Ablösen der Zellen unter dem Mikroskop kontrollieren
=> mind. 90% der Zellen sollten beginnen sich abzurunden bzw. abzuschwimmen
6. mittels Pipette die Zellsuspension resuspendieren (´tritorieren`) und in ein
Zentrifugenröhrchen mit mind. doppeltem Volumen Medium (+10% Serum oder
Trypsininhibitor)
überführen und mischen.
Optional:

- Abzentrifugieren der Zellen (300 x g)
- Überstand abnehmen
- Zellpellet in frischem Medium resuspendieren

7. Zellen aussäen (nach vorgegebener Zellzahl oder nach Verdünnungsfaktor)

Zellkultur

Was ist Trypsin, warum mischt man es mit EDTA/EGTA beim Passagieren und was muss beim Passagieren beachtet werden ?

Eine Protease, die die Zell-Matrix-Kontakte verdaut. "Detachment"

Abstoppen der Reaktion mit Serum/Medium erforderlich, damit Oberflächenproteine nicht gespalten werden.

EDTA löst Zell-Zell-Kontakte.

Zellkultur

Welche Methoden gibt es noch zum Passagieren von adhärenten Zellkulturen?

  • Shake-off
  • Abschaben

Zellkultur

Wie funktioniert das Shake-off-Verfahren?

  • Abklopfen
  • Abspülen
  • innerhalb von 30 min. wiederholen, um Ausbeute zu steigern

!Nur Zellen, die locker an Substrat gebunden sind

ODER

Zellen in Mitose

=> Zellen wachsen synchron

Zellkultur

Was ist der Vorteil und der Nachteil beim Passagieren durch Abschaben?

+ Zellmembranen bleiben unverdaut

- einige Zellen werden mechanisch geschädigt

Zellkultur

Was gehört zur Ausstattung des Sterilbereiches?

  • Sterile Werkbank mit Arbeitsmaterial
  • CO2-Inkubator
  • Invertmikroskop mit Phasenkontrast 
  • Kühlzentrifuge
  • Wasserbad
  • Schränke
  • Kühl/-Gefrierschrank
  • Abfallentsorgung
  • Waschbecken
  • Verbrauchsmaterial

Zellkultur

Ausstattung der Sicherheitswerkbank und Zubehör?

  • Vakuumanschluss in der Werkbank und
    Vakuumpumpe außerhalb der Werkbank
  • Arbeitsplatte aus Edelstahl,
    Auffangbecken
  • Beleuchtung
  • UV-Lampe
    (bei 30-50 cm Reichweite zur Keimabtötung)
  • Pipettierhilfen

Zellkultur

Nenne ein paar wichtige Verhaltensregeln bei Arbeiten an der Sterilbank

  • Werkbank vor und nach der Arbeit 10 min laufen lassen
  • Vor Arbeitsbeginn und danach mit 80% Alkohol reinigen
  • Nur sterile Sachen in die Werkbank bringen
  • Nicht über offene Schalen und Flaschen hantieren
  • Werkbank nicht zu voll stellen 

Zellkultur

Auf welche 2 Arten kann Temperatur geregelt werden in CO2-Inkubator? Vorteile/Nachteile

  • Temperaturregelung mit Wassermantel
    • hohe Temperaturkonstanz aber langsame Anpassung bei Veränderung
  • Temperaturregulung über Luftmantel-Inkubatoren
    • schnelle Temperaturerholung, aber schlechte Konstanz

Zellkultur

Warum braucht man ein CO2-Inkubator?

  • alle zelluläre Prozesse sind temperaturabhängig
  • Enzyme haben ein Temperaturoptimum 

Zellkultur

Welche 2 Materialien eigenen sich als Innenauskleidung bei CO2-Inkubator? Vorteile/Nachteile

  • Aus Kupfer (Reinigung alle 6 Wochen)
    • Vorteil: Kupfer wirkt bakteriostatisch und fungizid
    • Nachteil: teuer
  • Edelstahl (Reinigung alle 2 Wochen)
    • Vorteil: günstiger
    • Nachteil: pflegeintensiver, da Edelstahl Substrat für Kontaminationen 

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