Gentechnik at Hochschule Weihenstephan-Triesdorf

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 Mendel'sche Regeln: Beobachtungen und Schlüsse: (Prinzip der unabhängigen Segregation)

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Fazit zu Gregor Mendel 

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DNA Doppelhelix nach Watson und Crick 

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Unterschiede RNA zu DNA 

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Definition Molekulare Klonierung und benötigte Komponenten 

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5 Insert Möglichkeiten für die Klonierung (Ausgangsmaterial)

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Wichtiges zu Beachten bei der Ligation von Vektor und DNA 

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Arbeitsschritte zur Identifikation ob Transformation funktioniert hat

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Klonierungsvektoren Eigenschaften

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Plasmid Aufbau und Eigenschaften 

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Klonierungsvektoren auf der Basis von E.coli-Plasmiden: Beschaffung und Eigenschaften 

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Zellextrakt Herstellung und Gewinnen der DNA daraus

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Gentechnik

 Mendel'sche Regeln: Beobachtungen und Schlüsse: (Prinzip der unabhängigen Segregation)

Beobachtungen: 

  • Nachkommen wiesen alle gleiche Ausprägung des betrachteten Merkmals, wie eines der Eltern auf
  • 3:1 Verhältnis unter den F2-Nachkommen 

Schlüsse:

  • Merkmale werden alle durch ein paar von Genen kontrolliert (1 Mutter, 1 Vater) 
  • reinerbige Nachkommen enthalten 2 Allele des Gens (RR)
  • Homozygot: Genpaar identisch (rr,RR)
  • Heterozygot: Genpaar nicht identisch (rR,Rr)

Gentechnik

Fazit zu Gregor Mendel 

  • G.M. formulierte Gesetzmäßigkeiten, mit denen sich die Vererbung biologischer Merkmale erklären lässt 
  • den Gesetzen liegt die Annahme zugrunde, jede Eig. werde von einem Gen gesteuert
  • die Genetik hat das Ziel, das Wesen der Gene zu verstehen und die Wirkungsweise zu erklären 

Gentechnik

DNA Doppelhelix nach Watson und Crick 

  • die beiden DNA-Ketten werden durch H-Brücken zusammengehalten
  • nicht kovalent -> Hitze spaltet
  • Zucker+Base sind durch Phosphodiester-Verknüpfung vernüpft (kovalent)

Gentechnik

Unterschiede RNA zu DNA 

  • einzelsträngig
  • Uracil statt Thymin
  • -OH an Zucker -> dient als Matrize der Translation (Polymerase braucht 3' OH !)

Gentechnik

Definition Molekulare Klonierung und benötigte Komponenten 

  • Herstellung rekombinanter DNA-Moleküle
  • Transformation in einen Wirtsorganismus, wo sie repliziert werden 
  • 2 Komponenten: 
    • Ziel-DNA-Fragment (Insert)
    • Vektor bzw. Plasmid mit allen Bestandteilen zur Replikation 

Gentechnik

5 Insert Möglichkeiten für die Klonierung (Ausgangsmaterial)

  • Plasmid (mit RE's ausschneiden) 
  • gDNA
  • PCR Produkt
  • annealed oligos (einzelne Oglionukleotide)
  • cDNA (hergestellt von Reverser Transkriptase) 

Gentechnik

Wichtiges zu Beachten bei der Ligation von Vektor und DNA 

  • Enden von Ziel-DNA und Vektor müssen modifiziert werden -> kompatibel 
  • brauchen 5´-Phosphat und 3´-OH 
  • nach RE-Verdau haben sie das 
  • bei PCR-DNA fehlt das 5´ Phosphat -> phosphorylierte Primer nehmen 
  • Dephosphorylierung durch Phosphatase-Behandlung des Vektors verhindert Selbstligation 

Gentechnik

Arbeitsschritte zur Identifikation ob Transformation funktioniert hat

  • Zellen bilden Kolonien
  • Aufbrechen und Plasmid-DNA isolieren
  • Plasmide isolieren und analysieren (RE-Verdau, Sequenzieren) 
  • Klone isolieren und kultivieren 

Gentechnik

Klonierungsvektoren Eigenschaften

  • muss in der Wirtszelle vermehrbar sein 
  • geringe Größe (unter 10kB) -> größere Moleküle brechen beim Reinigen leicht auseinander
  • Auffindbar in: 
    • in Bakterien: Plasmide, Bakteriophagenchromosomen

Gentechnik

Plasmid Aufbau und Eigenschaften 

  • ringförmige DNA 
  • eigenständiges Dasein in Bakterienzelle
  • enthalten fast immer 1-2 Gene mit nützlicher Eig. für die Zelle (zB. AB-Resistenz) 
  • Replikationsstartpunkt (ori)

Gentechnik

Klonierungsvektoren auf der Basis von E.coli-Plasmiden: Beschaffung und Eigenschaften 

  •  beziehbar von kommerziellen Anbietern 
  • Eigenschaften: 
    • leicht reinigbar 
    • Transformation mit hoher Effizienz 
    • geeignete Marker (Selektion Transformanten)
    • recht große DNA-Stücke klonierbar (bis zu 8 kB) 

Gentechnik

Zellextrakt Herstellung und Gewinnen der DNA daraus

  • eine Bakterienkultur wird herangezüchtet 
  • Zentrifugation
  • Zellen werden entnommen und aufgebrochen -> Zellextrakt entsteht 
  • DNA wird aus dem Extrakt gereinigt und angereichert 

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