BBP/Proteine at Freie Universität Berlin | Flashcards & Summaries

Lernmaterialien für BBP/Proteine an der Freie Universität Berlin

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TESTE DEIN WISSEN

Informationen aus Primärstruktur (6)

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TESTE DEIN WISSEN

1. Vergleich mit bekannten Sequenzen aus Proteindatenbank: Proteinfamilie, Schlussfolgerung auf Struktur und Funktion

2. Konservierte Sequenzmotive/Domänen: Schlussfolgerung auf Funktion und mögliche Bindungspartner

3. Signalsequenzen: Lokalisation/Prozessierung

4. Vorhersagen über Sekundär- und Tertiärstruktur

5. physikalisch-chemische Eigenschaften: Molekulargewicht, pI, Extinktionskoeffizient, Hydrophobizität, Ladung, geschätzte Halbwertszeit

6.Vergleich mit gleichem Protein in anderen Spezies: wie hoch ist Sequenz konserviert? --> Evolutionsweg

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TESTE DEIN WISSEN

Edman-Abbau

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TESTE DEIN WISSEN

1. Reaktion von PITC mit N-Terminus

2. Trennung der Markierung inklusive N-terminaler AS

3. Identifikation der abgetrennten AS und Wiederholung von Schritt eins (sequenziell)

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TESTE DEIN WISSEN

Bestimmung des C-Terminus

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TESTE DEIN WISSEN

- chemisch schwierig zu bestimmen

1. Behandlung des Peptids mit Casen (Carboxypeptidasen) --> Abbau ausgehend vom C-Terminus

2. Analyse des Zeitverlaufes

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TESTE DEIN WISSEN

Ermittelung der AS-Zusammensetzung

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TESTE DEIN WISSEN

1. Totalhydrolyse (HCl)

2. Auftrennung der AS z.B. durch Ionenaustauschchromatographie

3. Bestimmung der AS-Mengen durch Ninhydrin oder Fluorescamin

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TESTE DEIN WISSEN

Bestimmung des N-Terminus

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TESTE DEIN WISSEN

1. Peptid wird mit PITC (Edman-Reagenz), Danyslchlorid oder FDNB (Sanger-Reagenz) behandelt --> reagiert mit N-Terminus

(2. Totalhydrolyse)

3. Identifikation der markierten AS (chromatographisch)

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TESTE DEIN WISSEN

Möglichkeiten für partiellen Verdau von Proteinen

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TESTE DEIN WISSEN

enzymatisch (Proteasen):

- Trypsin: Lys, Arg

- Chymotrypsin: Phe, Trp

- Elastase: Ala, Val


chemische: 

- Bromcyan: Met

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TESTE DEIN WISSEN

ESI (Electronspray Ionization)

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TESTE DEIN WISSEN

- Probe wird als Aerosol in Kammer mit elektrischem Feld gesprüht --> Taylor-Kegel

- Ansammlung von negativ geladenen Ionen an Spitze, positiv geladene Ionen wandern Richtung Austrittsplatte

- Tröpfchen spaltet sich durch Coulomb-Explosionen auf

Probe geht über in Gasphase

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TESTE DEIN WISSEN

MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization)

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TESTE DEIN WISSEN

- Matrix aus organischer Substanz (Dihydroxybenzoesäure) befördert Probe schonend in Gasphase

- Matrix nimmt Energie von Laser auf und führt zur explosionsartigen Teilchenablösung

- Protonierung der Analytmoleküle durch organische Matrix (=Säure)

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TESTE DEIN WISSEN

TOF (Time of Flight)

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TESTE DEIN WISSEN

- Auftrennung nach m/z mittels Bewegung über Driftstecke --> time of flight ist proportional zur Wurzel von m/z

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TESTE DEIN WISSEN

Sanger-Sequenzierung

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TESTE DEIN WISSEN

1. N-Terminus wird markiert (FDNB)

2. Peptid partiell verdaut

3. AS-Zusammensetzung der N-terminalen Fragmente

4. Isolierung und Markierung der restlichen Fragmente --> AS-Zusammensetzung bestimmen

5. Informationen zur Sequenz zusammenfügen

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TESTE DEIN WISSEN

De-novo-Peptidsequenzierung mit MS

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TESTE DEIN WISSEN

MS-MS-Tandem:

1. Ionisierung

2. m/z Separation

3. Fragmentierung

4. m/z Separation

5. Detektion

--> Fragmentionsreihe erlaubt über Berechnung der Massendifferenz Rückschluss auf Proteinsequenz


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TESTE DEIN WISSEN

Peptide Mass Fingerprinting

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TESTE DEIN WISSEN

Massenspektrometrische Analyse und Vergleich mit Datenbanksuche zur Identifikation von bekannten Fragmentmustern

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Q:

Informationen aus Primärstruktur (6)

A:

1. Vergleich mit bekannten Sequenzen aus Proteindatenbank: Proteinfamilie, Schlussfolgerung auf Struktur und Funktion

2. Konservierte Sequenzmotive/Domänen: Schlussfolgerung auf Funktion und mögliche Bindungspartner

3. Signalsequenzen: Lokalisation/Prozessierung

4. Vorhersagen über Sekundär- und Tertiärstruktur

5. physikalisch-chemische Eigenschaften: Molekulargewicht, pI, Extinktionskoeffizient, Hydrophobizität, Ladung, geschätzte Halbwertszeit

6.Vergleich mit gleichem Protein in anderen Spezies: wie hoch ist Sequenz konserviert? --> Evolutionsweg

Q:

Edman-Abbau

A:

1. Reaktion von PITC mit N-Terminus

2. Trennung der Markierung inklusive N-terminaler AS

3. Identifikation der abgetrennten AS und Wiederholung von Schritt eins (sequenziell)

Q:

Bestimmung des C-Terminus

A:

- chemisch schwierig zu bestimmen

1. Behandlung des Peptids mit Casen (Carboxypeptidasen) --> Abbau ausgehend vom C-Terminus

2. Analyse des Zeitverlaufes

Q:

Ermittelung der AS-Zusammensetzung

A:

1. Totalhydrolyse (HCl)

2. Auftrennung der AS z.B. durch Ionenaustauschchromatographie

3. Bestimmung der AS-Mengen durch Ninhydrin oder Fluorescamin

Q:

Bestimmung des N-Terminus

A:

1. Peptid wird mit PITC (Edman-Reagenz), Danyslchlorid oder FDNB (Sanger-Reagenz) behandelt --> reagiert mit N-Terminus

(2. Totalhydrolyse)

3. Identifikation der markierten AS (chromatographisch)

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Q:

Möglichkeiten für partiellen Verdau von Proteinen

A:

enzymatisch (Proteasen):

- Trypsin: Lys, Arg

- Chymotrypsin: Phe, Trp

- Elastase: Ala, Val


chemische: 

- Bromcyan: Met

Q:

ESI (Electronspray Ionization)

A:

- Probe wird als Aerosol in Kammer mit elektrischem Feld gesprüht --> Taylor-Kegel

- Ansammlung von negativ geladenen Ionen an Spitze, positiv geladene Ionen wandern Richtung Austrittsplatte

- Tröpfchen spaltet sich durch Coulomb-Explosionen auf

Probe geht über in Gasphase

Q:

MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization)

A:

- Matrix aus organischer Substanz (Dihydroxybenzoesäure) befördert Probe schonend in Gasphase

- Matrix nimmt Energie von Laser auf und führt zur explosionsartigen Teilchenablösung

- Protonierung der Analytmoleküle durch organische Matrix (=Säure)

Q:

TOF (Time of Flight)

A:

- Auftrennung nach m/z mittels Bewegung über Driftstecke --> time of flight ist proportional zur Wurzel von m/z

Q:

Sanger-Sequenzierung

A:

1. N-Terminus wird markiert (FDNB)

2. Peptid partiell verdaut

3. AS-Zusammensetzung der N-terminalen Fragmente

4. Isolierung und Markierung der restlichen Fragmente --> AS-Zusammensetzung bestimmen

5. Informationen zur Sequenz zusammenfügen

Q:

De-novo-Peptidsequenzierung mit MS

A:

MS-MS-Tandem:

1. Ionisierung

2. m/z Separation

3. Fragmentierung

4. m/z Separation

5. Detektion

--> Fragmentionsreihe erlaubt über Berechnung der Massendifferenz Rückschluss auf Proteinsequenz


Q:

Peptide Mass Fingerprinting

A:

Massenspektrometrische Analyse und Vergleich mit Datenbanksuche zur Identifikation von bekannten Fragmentmustern

BBP/Proteine

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