BBP Kohlenhydrate at Freie Universität Berlin

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Schilddrüsenaufbau

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Thyroglobulin-Synthese/-Exozytose

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Ninhydrin-Test

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Größenausschlusschromatographie

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Ionenaustauschchromatographie

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Neutralzucker-Nachweis

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Sialinsäure-Nachweis

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transiente Transfektion

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HeLa-Zellen

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Zellkulturmedium

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Thyroglobulin

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BBP Kohlenhydrate

Schilddrüsenaufbau

  • einschichtige Zellanordnung aus Follikelepithelzellen (Thyreozyten)
  • Innenraum umschließend (Lumen) -> Ort zur Bildung der Schilddrüsenhormone (T3 + T4)

BBP Kohlenhydrate

Thyroglobulin-Synthese/-Exozytose

  1. Translation von Thyroglobulin ins ER der Follikelepithelzellen
  2. Thyroglobulin-Exozytose ins Lumen
  3. Aktiver Transport von Iodid aus dem Blut ins Lumen
  4. Iodierung der Thyrosylreste des Thyroglobulins
  5. Endozytose von iodierten Thyroglobulin in die Follikelepithelzellen mittels Megalin (TSH-stimuliert)
  6. Freisetzung von Thyroxin (T4)
  7. Sekretion ins Blut durch Proteolyse


-> pro Tg-Molekül: >100 Tyrosinreste -> 20 werden iodiert -> 10 T3/4-Moleküle

BBP Kohlenhydrate

SDS Page

  • alle 2 Moleküle lagert sich ein SDS-Molekül an -> Denaturierung
  • konstantes Masse/Ladungsverhältnis
  • Wandergeschwindigkeit nur noch von Proteingröße abhängig

BBP Kohlenhydrate

Ninhydrin-Test

  • dimerisiert durch Reaktion mit primären Aminogruppen von freien Aminosäuren -> Ruhemann's Purpur (570 nm)
  • Prolin regiert zu gelbem Produkt (400 nm) -> anderer Reaktionsmechanismus
  • Anwendung: DC von Aminosäuren, Forensik: Fingerabdrücke auf Papier
  • Positivkontrolle: Glycin
  • Leerwert: Natriumacetat

BBP Kohlenhydrate

Größenausschlusschromatographie

  • mobile Phase bewegt sich an stationärer Phase vorbei + nimmt Stoffe unterschiedlich schnell mit
  • Verteilung aufgrund von Größe und Fom
  • Sephadex G-25 trennt niedermolekulare Moleküle
  • UV-Absorption der Peptidbindung bei 195 nm
  • Standardlauf: Blue Dextran, Vitamin B12, Tyrosin

BBP Kohlenhydrate

Ionenaustauschchromatographie

  • Trennprinzip: elektrostatische WW -> kompetitive WW geladener Ionen; Probenmolekül konkurriert mit Salz-Ionen um geladene Positionen auf Matrix
  • Elution: steigende Salzkonzentration (höhere Ionenstärke), pH-Änderung (Protein-Ladung ist pH-abhängig)
  • Kationenaustauscher: negativ geladene Matrix, Anionenaustauscher: positiv geladene Matrix -> DEAE

BBP Kohlenhydrate

Neutralzucker-Nachweis

  • basierend auf Seliwanow's-Test zur Unterschiedung von Aldosen/Ketosen
  • Absorption bei 430 nm
  • Neutralzucker im Thyroglobulin: Fucose, Galaktose, Mannose; negativ für NANA, GlcNAc
  • Positivkontrolle: Mannose
  • Negativkontrolle: Tris-Acetat-Puffer
  • Leerwert: Puffer

BBP Kohlenhydrate

Sialinsäure-Nachweis

  • Entstehung eines Chromophors
  • Absorption bei 620 nm
  • Positivkontrolle: NANA
  • Negativkontrolle: Mannose
  • Leerwert: Startpuffer Anionenaustauscher

BBP Kohlenhydrate

transiente Transfektion

- Transfektion: Einbringen fremder DNA/RNA in eukaryotische Zellen


- Methoden:

-> Aufnahme durch Endozytose (Calciumphosphat, DEAE-Dextran, PEI)

-> Fusion mit Zellen (Lipofektion)

-> Elektroporation, Nukleofektion

-> Mikroinjektion

-> Virus-vermittelt, retroviral

BBP Kohlenhydrate

HeLa-Zellen

  • untersch. Zelllinien = untersch. Ansprüche -> Bsp. Neuronen vs HeLa (Neuronen benötigen spezielle Wachstumsfaktoren)
  • Biobanken geben Handhabung an -> Eigenschaften, Medien, Konfluidität

BBP Kohlenhydrate

Zellkulturmedium

  • DMEM
  • FCS (10 %)
  • Glutamin (5 %)
  • (Antibiotika)

BBP Kohlenhydrate

Thyroglobulin

  • Glykoprotein -> N-Glykosyliert
  • ca. 2800 AS, 230 kDa
  • Homodimer
  • ca. 50% der Proteinmenge der Schilddrüse
  • sorgt für Synthese von Thyroxin (T4) und Triiodthyronin (T3)
  • Funktion: Regulation der Genexpression, erhöhte Stoffwechselaktivität des Protein-Turn-Overs, Kontrolle von Entwicklung + Metabolismus

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