Bioanalytik at FHNW - Fachhochschule Nordwestschweiz | Flashcards & Summaries

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Lernmaterialien für Bioanalytik an der FHNW - Fachhochschule Nordwestschweiz

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Warum wird z.B. Guanidinium Isocyanat nicht verwendet bei der Fällung von Enzymen bei einer klassischen Reinigung?

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Guanidinium Isocyanat ist antichaotrop. Daher verändert es die Lösungsmitteleigenschaften. Dies sorgt dafür, dass es mehr hydrophob wird wodurch es schneller ausfällt. Aber die Proteine entfalten sich, deshalb wird es nicht sehr oft verwendet

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Wann wird Guanidinium Isocyanat eingesetzt?

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Antwort suchen

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Was ist das Trennprinzip bei einer Zonengradientenzentrifugation?

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Das Protein wird reinzentrifugiert. Es wandert entsprechend der Grösse und nicht entsprechend der Dichte. Das Protein würde durchwandern, wird jedoch durch die Gradienten zurückgehalten.

Präparativ wichtig, da grosse Komplexe schonend gereinigt werden können

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Erklären Sie wie man Zentrifugation benutzen kann, um z.B. in der Biotechnologie bei der Herstellung von rekombinanten AAV, leere Virenpartikel, von gefüllten und von freier DNA unterscheiden kann

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Durch die drei unterschiedliches Dichten. Die Dichte der funktionalen Teile unterscheiden sich auch. Dadurch kann man direkt quantifizieren durch Brechnungsindex oder anderes (präparativ oder analytisch)

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Warum werden häufig bei langwierigen Arbeiten mit Proteinen, wie z.B. der Reinigung von Proteinen, folgende Bestandteile dem Puffer zugesetzt

  • Dithiothreitol (DTT)
  • Proteaseinhibitor
  • Detergenzien
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  • DTT: Disulfidbrücken können aufrecht erhalten werden (Reduktionsmittel), häufig hinzugefügt um richtiges Milieu aufrecht zu erhalten
  • Proteaseinhibitor: Proteasen werden durch mischen freigesetzt um diese dann zu inhibieren oder in unserer Haut etc. also Infektionen zu verhindern werden diese verwendet
  • Detergenzien: bei Aufschluss von Zellen da es die Membran solobilisiert. Aber auch die Solobilisierung allgmein von allen Bestandteilen.
    Lagern sich auch an Oberflächen an und verhindern so die Interaktion, somit können Proteine deutlich besser in Lösung behalten
    Detergenzien müssen nach der Lyse entfern werden
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Beschreiben Sie das Prinzip der Isoelektrischen Fokusierung? Wie wird dabei die Trennstrecke aufgebaut?

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Dabei wird Protein nach Isoelektrischen Punkt aufgetrennt.

Auf der einen Seite ist ein hoher pH auf der anderen Seite ein tiefer pH. Dort wo die Proteine die Nettoladung = 0 haben, bleibt das Protein stehen. Dies ist der Fall beim Isoelektrischen Punkt. Dort wird es also "fokusiert"

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Wie kann man bei der Isoelektrischen Fokusierung den Gradienten herstellen?

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Variante 1: Durch Giessen von Polyacrylamidgel, beim Giessen kann man auf der einen Seite saure Gruppen hinzufügen und auf der anderen Seite basische Gruppen. Dadurch entsteht ein pH-Gradienten. Dies ist aber im Labor schwer herzustellen, deshalb kauft man die meisten

Variante 2: NACHSEHEN

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Sie stehen vor der Aufgabe verschiedenen monoklonale AK per Elektrophorese unterscheiden zu müssen. Die AK sind alle für das gleiche Antigen spezifisch. IgG AK bestehen dabei jeweils aus zwei leichten und zwei schweren Ketten und unterscheiden sich nur in ihrer Antigenbindestelle. Welche Methode verwenden Sie und warum?

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Anwendung von Isoelektrischer Fokusierung, da der Isoelektrische Punkt einen leichten Shift erhält

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Beschreiben Sie das Prinzip der 2D Gelelektrophorese

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Man nutzt zwei Eigenschaften zur Auftrennung. Beispielsweise Kopplung mit SDS-Page mit isoelektrischer Fokusierung. Also eine Kombination von orthogonalen Methoden

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Nennen und erklären Sie die Stärken und Schwächen der 2D Gelelektrophorese

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Schwäche: Man benötigt viel Material, arbeitsintensiv aber das grosse Problem, wie macht man die Trennung reproduzierbar? Dies ist ein Problem, da der pH Gradient nicht optimal reproduzierbar

Stärke: NACHSEHEN

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Ctk ist eine Kinase, die die Transkription in eukaryotischen Zellen beeinflusst. Sie haben Ctk1 gereinigt und vermuten es könnte durch Ctk1 eine Untereinheit der RNA-Polymerase phosphoryliert werden. Wie könnten Sie dies in vitro einfach beweisen?

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  • Farbstoff kann spezifisch phosphoryliert werden
  • Ctk ist gereinigt, dann kann man RNA-Polymerase mit ATP gemischt werden. Also macht man RNA-Polymerase einmal mit und einmal ohne Ctk und dann mit der phosphorstaining Färbung schauen ob zusätzliche Phosphorylierung entsteht. Man sieht somit nicht ob es phosphoryliert wird sondern man sieht auch noch die Untereinheiten
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Ammoniumsulfat kann in der Proteinreinigung zur Präzipitation verwendet werden. Beschreiben Sie kurz das Vorgehen und warum Proteine ausfallen

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Ammoniumsulfat ist kein chaotropes Salz. Es zerstört prinzipiell die Struktur nicht, jedoch entzieht es Wasser aus der Hydrathülle des Proteines. Dadurch wird das Protein unlöslich und es beginnt auszufallen

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Q:

Warum wird z.B. Guanidinium Isocyanat nicht verwendet bei der Fällung von Enzymen bei einer klassischen Reinigung?

A:

Guanidinium Isocyanat ist antichaotrop. Daher verändert es die Lösungsmitteleigenschaften. Dies sorgt dafür, dass es mehr hydrophob wird wodurch es schneller ausfällt. Aber die Proteine entfalten sich, deshalb wird es nicht sehr oft verwendet

Q:

Wann wird Guanidinium Isocyanat eingesetzt?

A:

Antwort suchen

Q:

Was ist das Trennprinzip bei einer Zonengradientenzentrifugation?

A:

Das Protein wird reinzentrifugiert. Es wandert entsprechend der Grösse und nicht entsprechend der Dichte. Das Protein würde durchwandern, wird jedoch durch die Gradienten zurückgehalten.

Präparativ wichtig, da grosse Komplexe schonend gereinigt werden können

Q:

Erklären Sie wie man Zentrifugation benutzen kann, um z.B. in der Biotechnologie bei der Herstellung von rekombinanten AAV, leere Virenpartikel, von gefüllten und von freier DNA unterscheiden kann

A:

Durch die drei unterschiedliches Dichten. Die Dichte der funktionalen Teile unterscheiden sich auch. Dadurch kann man direkt quantifizieren durch Brechnungsindex oder anderes (präparativ oder analytisch)

Q:

Warum werden häufig bei langwierigen Arbeiten mit Proteinen, wie z.B. der Reinigung von Proteinen, folgende Bestandteile dem Puffer zugesetzt

  • Dithiothreitol (DTT)
  • Proteaseinhibitor
  • Detergenzien
A:
  • DTT: Disulfidbrücken können aufrecht erhalten werden (Reduktionsmittel), häufig hinzugefügt um richtiges Milieu aufrecht zu erhalten
  • Proteaseinhibitor: Proteasen werden durch mischen freigesetzt um diese dann zu inhibieren oder in unserer Haut etc. also Infektionen zu verhindern werden diese verwendet
  • Detergenzien: bei Aufschluss von Zellen da es die Membran solobilisiert. Aber auch die Solobilisierung allgmein von allen Bestandteilen.
    Lagern sich auch an Oberflächen an und verhindern so die Interaktion, somit können Proteine deutlich besser in Lösung behalten
    Detergenzien müssen nach der Lyse entfern werden
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Q:

Beschreiben Sie das Prinzip der Isoelektrischen Fokusierung? Wie wird dabei die Trennstrecke aufgebaut?

A:

Dabei wird Protein nach Isoelektrischen Punkt aufgetrennt.

Auf der einen Seite ist ein hoher pH auf der anderen Seite ein tiefer pH. Dort wo die Proteine die Nettoladung = 0 haben, bleibt das Protein stehen. Dies ist der Fall beim Isoelektrischen Punkt. Dort wird es also "fokusiert"

Q:

Wie kann man bei der Isoelektrischen Fokusierung den Gradienten herstellen?

A:

Variante 1: Durch Giessen von Polyacrylamidgel, beim Giessen kann man auf der einen Seite saure Gruppen hinzufügen und auf der anderen Seite basische Gruppen. Dadurch entsteht ein pH-Gradienten. Dies ist aber im Labor schwer herzustellen, deshalb kauft man die meisten

Variante 2: NACHSEHEN

Q:

Sie stehen vor der Aufgabe verschiedenen monoklonale AK per Elektrophorese unterscheiden zu müssen. Die AK sind alle für das gleiche Antigen spezifisch. IgG AK bestehen dabei jeweils aus zwei leichten und zwei schweren Ketten und unterscheiden sich nur in ihrer Antigenbindestelle. Welche Methode verwenden Sie und warum?

A:

Anwendung von Isoelektrischer Fokusierung, da der Isoelektrische Punkt einen leichten Shift erhält

Q:

Beschreiben Sie das Prinzip der 2D Gelelektrophorese

A:

Man nutzt zwei Eigenschaften zur Auftrennung. Beispielsweise Kopplung mit SDS-Page mit isoelektrischer Fokusierung. Also eine Kombination von orthogonalen Methoden

Q:

Nennen und erklären Sie die Stärken und Schwächen der 2D Gelelektrophorese

A:

Schwäche: Man benötigt viel Material, arbeitsintensiv aber das grosse Problem, wie macht man die Trennung reproduzierbar? Dies ist ein Problem, da der pH Gradient nicht optimal reproduzierbar

Stärke: NACHSEHEN

Q:

Ctk ist eine Kinase, die die Transkription in eukaryotischen Zellen beeinflusst. Sie haben Ctk1 gereinigt und vermuten es könnte durch Ctk1 eine Untereinheit der RNA-Polymerase phosphoryliert werden. Wie könnten Sie dies in vitro einfach beweisen?

A:
  • Farbstoff kann spezifisch phosphoryliert werden
  • Ctk ist gereinigt, dann kann man RNA-Polymerase mit ATP gemischt werden. Also macht man RNA-Polymerase einmal mit und einmal ohne Ctk und dann mit der phosphorstaining Färbung schauen ob zusätzliche Phosphorylierung entsteht. Man sieht somit nicht ob es phosphoryliert wird sondern man sieht auch noch die Untereinheiten
Q:

Ammoniumsulfat kann in der Proteinreinigung zur Präzipitation verwendet werden. Beschreiben Sie kurz das Vorgehen und warum Proteine ausfallen

A:

Ammoniumsulfat ist kein chaotropes Salz. Es zerstört prinzipiell die Struktur nicht, jedoch entzieht es Wasser aus der Hydrathülle des Proteines. Dadurch wird das Protein unlöslich und es beginnt auszufallen

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