Gentechnik II at Fachhochschule Aachen | Flashcards & Summaries

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Lernmaterialien für Gentechnik II an der Fachhochschule Aachen

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TESTE DEIN WISSEN
Was ist eine Taq Man Probe ? Wofür genutzt?
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TESTE DEIN WISSEN
  • Sequenzspezifisches Oligonukleotid mit einem Reporter Fluoreszenzfarbstoff und einem Quencher
  • ist der Quencher in der Nähe des Reporters nimmt er über Förster-Resonanzenergietransfer einen Teil der Energie des Reporters auf und unterdrückt die Fluoreszenz
  • trifft die taq-Polymerase auf die Probe wird diese abgebaut —> Entfernung zwischen Quencher und Reporter nimmt zu —> Reporter Fluoreszenz nimmt zu 
  • wird für die qPCR genutzt 
  • Pro: spezifisch , multiplexen möglich 
  • Con: aufwendig und Teuer 
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TESTE DEIN WISSEN
Weiterentwicklungen der Sanger Methode
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TESTE DEIN WISSEN
  • Kopplung jedes der ddNTPs mit einem anderen Farbstoff —> Auftrennen in 4 Ansätze entfällt
  • Auftrennung mittels Kapillarelektrophorese —> höherer Durchsatz und automatisierbar
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TESTE DEIN WISSEN
Homologous recombination repair system 
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TESTE DEIN WISSEN
  • Uses sister chromatid as template for repairing 
  • processes 5ènds by nucleases 
  • more accurate but only after replication possible 
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TESTE DEIN WISSEN
Non-homologes end joining (NHEJ)
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TESTE DEIN WISSEN
  • Recognition of double strand breaks by Ku protein
  • End processing through removal of damaged or mismatched nucleotides by nucleuses + resynthesis by polymerases
  • end joining by ligase 
  • Product usually alters the original by a few nucleotides 
  • takes plays before repairing 
  • „quick and dirty“
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TESTE DEIN WISSEN
qPCR 
Prinzip
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TESTE DEIN WISSEN
  • Auf der PCR beruhenden Amplifikationsmethode zur DNA Quantifizierung
  • Messung erfolgt in Echtzeit mittels UV-Messung
  • Ermittlung eines definierten Schwellenwerts bei Der Produktamplifikation in der exponentiellen Phase
  • Zeit zum erreichen des Schwellenwerts abhängig von der Menge an Ausgangs DNA
  • Nachweismethoden : DNA-interkalierende Farbstoffe (SYBR Green), Hybridisierungssonden (Taq-Man,Scorpion, Beacon)
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TESTE DEIN WISSEN
Sanger Methode
Prinzip , Ablauf 
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TESTE DEIN WISSEN
  • DNA Synthese durch DNA-Polymerasen in Gegenwart geringer Konzentrationen 2‘,3‘-Didesoxynukleosidtriphosphaten (ddNTPs)
  • ddNTPs haben keine 3‘OH Gruppe, wird es eingebaut kommt es zum Kettenabbruch
  • Verwendung eines markierten Primers
  • 4 seperate Sequenzierungsreaktionen mit einem der ddNTPs in geringer Konz. + dNTPs
  • man erhält durch den zufälligen Kettenabbruch unterschiedlich lange DNA-Sequenzen
  • aus dem Gel,lässt sich dann die Sequenz ableiten 
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TESTE DEIN WISSEN
Niedermolekulare Wirkstoffe (small molecules)
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TESTE DEIN WISSEN
sind chemisch herstellbare Arzneistoffe mit geringer Molekülmasse (i.d.R. <800 g/mol) und meist relativ einfachen Strukturformeln
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TESTE DEIN WISSEN
The 3 phases of CRISPR/Cas-mediated immunity
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TESTE DEIN WISSEN
1. Spacer acquisition
  • after infection a short part of viral DNA ( 265-75 bp) is integrated as a spacer into the CRISPR gene locus
  • the CRSPR locus contains a repetition of conserved repeat sequences (for Cas9 binding) & different spacers, with each spacer representing a past infection -> can recognize future viral DNA
Step 2: Biogenesis of mature CRISPR RNA (crRNA)
  • expression of a RNA with all repeated sequences and spacers (pre-crRNA), Cas9 from cas operon and transactivating crRNA (tracrRNA)
  • complex building with pre-crRNA, tracrRNA and Cas 9 -> single complexes are released through cleavage by RNAse III
  • the crRNA/tracrRNA/Cas9- complex is now ready to search for viral DNA complementary to the spacer sequence
Step 3: Interference
  • The crRNA/tracrRNA/Cas9-complex recognizes the viral sequence via complementary base pairing of the spacer => Cas9 destroys the viral DNA by cleavage
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TESTE DEIN WISSEN
The CRISPR system
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TESTE DEIN WISSEN
clustered regularly interspaced short palindromic repeats)
  •  A family of DNA sequences found in genomes of prokatyotes
  • protection against viruses 
  • Sequences are derived from viral DNA fragments from previous infections => used to destroy viral DNA in subsequent infections
  • Destruction is catalyzed by specifiv nucleases, e.g. Cas (CRISPR- associated) proteins => use transcribed CRISPR sequences as guide RNAs to recognize & cleave complementary DNA sequence
  • e.g. CRISPR type II protein Cas9 (Streptococcus pyogenes) CRISPR/Cas9 is now commenly used as a tool for gene editing
  • CRISPR system is directed against DNA 

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TESTE DEIN WISSEN
Use of the CRISPR/Cas9-system for gene editing
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TESTE DEIN WISSEN
  • A simplified version of of CRISPR/Cas9 has been established by fusing the crRNA & tracrRNA into a syn- thetic guide RNA (gRNA)
  • allows cutting the genome at a desired location
  • can be used to introduce mutations or to insert foreign DNA
  • can create gene knockouts
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TESTE DEIN WISSEN
small interfering RNAs (siRNAs)
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TESTE DEIN WISSEN
  • Primarily used by plants, worms & insects as a defense mechanism, against RNA viruses
  • less important for mammals because of their specialized immune systems
  • can silence mRNA: Cleavage of double-stranded RNA by Dicer to form siRNA duplex -> Binding to RITS/argonaute complex instead to RISC -> Binding to target RNA -> Transcriptional repression, e.g. by histone methylation
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TESTE DEIN WISSEN
Homologous recombination repair system for double strand breaks 
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TESTE DEIN WISSEN
  • Strand invasion from broken strand into intact duplex through complementary base pairing -> via repair polymerase
  • release of the invading strand and reforming of double helices 
  • strand invasion id catalysed by RecA/Rad51 proteins
  • HR can lead to loss of heterozygosity if the break is accidentally repaired by using the homologous chromosomes -> critical for cancer formation
  • HR must be tightly regulated
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Beispielhafte Karteikarten für deinen Gentechnik II Kurs an der Fachhochschule Aachen - von Kommilitonen auf StudySmarter erstellt!

Q:
Was ist eine Taq Man Probe ? Wofür genutzt?
A:
  • Sequenzspezifisches Oligonukleotid mit einem Reporter Fluoreszenzfarbstoff und einem Quencher
  • ist der Quencher in der Nähe des Reporters nimmt er über Förster-Resonanzenergietransfer einen Teil der Energie des Reporters auf und unterdrückt die Fluoreszenz
  • trifft die taq-Polymerase auf die Probe wird diese abgebaut —> Entfernung zwischen Quencher und Reporter nimmt zu —> Reporter Fluoreszenz nimmt zu 
  • wird für die qPCR genutzt 
  • Pro: spezifisch , multiplexen möglich 
  • Con: aufwendig und Teuer 
Q:
Weiterentwicklungen der Sanger Methode
A:
  • Kopplung jedes der ddNTPs mit einem anderen Farbstoff —> Auftrennen in 4 Ansätze entfällt
  • Auftrennung mittels Kapillarelektrophorese —> höherer Durchsatz und automatisierbar
Q:
Homologous recombination repair system 
A:
  • Uses sister chromatid as template for repairing 
  • processes 5ènds by nucleases 
  • more accurate but only after replication possible 
Q:
Non-homologes end joining (NHEJ)
A:
  • Recognition of double strand breaks by Ku protein
  • End processing through removal of damaged or mismatched nucleotides by nucleuses + resynthesis by polymerases
  • end joining by ligase 
  • Product usually alters the original by a few nucleotides 
  • takes plays before repairing 
  • „quick and dirty“
Q:
qPCR 
Prinzip
A:
  • Auf der PCR beruhenden Amplifikationsmethode zur DNA Quantifizierung
  • Messung erfolgt in Echtzeit mittels UV-Messung
  • Ermittlung eines definierten Schwellenwerts bei Der Produktamplifikation in der exponentiellen Phase
  • Zeit zum erreichen des Schwellenwerts abhängig von der Menge an Ausgangs DNA
  • Nachweismethoden : DNA-interkalierende Farbstoffe (SYBR Green), Hybridisierungssonden (Taq-Man,Scorpion, Beacon)
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Q:
Sanger Methode
Prinzip , Ablauf 
A:
  • DNA Synthese durch DNA-Polymerasen in Gegenwart geringer Konzentrationen 2‘,3‘-Didesoxynukleosidtriphosphaten (ddNTPs)
  • ddNTPs haben keine 3‘OH Gruppe, wird es eingebaut kommt es zum Kettenabbruch
  • Verwendung eines markierten Primers
  • 4 seperate Sequenzierungsreaktionen mit einem der ddNTPs in geringer Konz. + dNTPs
  • man erhält durch den zufälligen Kettenabbruch unterschiedlich lange DNA-Sequenzen
  • aus dem Gel,lässt sich dann die Sequenz ableiten 
Q:
Niedermolekulare Wirkstoffe (small molecules)
A:
sind chemisch herstellbare Arzneistoffe mit geringer Molekülmasse (i.d.R. <800 g/mol) und meist relativ einfachen Strukturformeln
Q:
The 3 phases of CRISPR/Cas-mediated immunity
A:
1. Spacer acquisition
  • after infection a short part of viral DNA ( 265-75 bp) is integrated as a spacer into the CRISPR gene locus
  • the CRSPR locus contains a repetition of conserved repeat sequences (for Cas9 binding) & different spacers, with each spacer representing a past infection -> can recognize future viral DNA
Step 2: Biogenesis of mature CRISPR RNA (crRNA)
  • expression of a RNA with all repeated sequences and spacers (pre-crRNA), Cas9 from cas operon and transactivating crRNA (tracrRNA)
  • complex building with pre-crRNA, tracrRNA and Cas 9 -> single complexes are released through cleavage by RNAse III
  • the crRNA/tracrRNA/Cas9- complex is now ready to search for viral DNA complementary to the spacer sequence
Step 3: Interference
  • The crRNA/tracrRNA/Cas9-complex recognizes the viral sequence via complementary base pairing of the spacer => Cas9 destroys the viral DNA by cleavage
Q:
The CRISPR system
A:
clustered regularly interspaced short palindromic repeats)
  •  A family of DNA sequences found in genomes of prokatyotes
  • protection against viruses 
  • Sequences are derived from viral DNA fragments from previous infections => used to destroy viral DNA in subsequent infections
  • Destruction is catalyzed by specifiv nucleases, e.g. Cas (CRISPR- associated) proteins => use transcribed CRISPR sequences as guide RNAs to recognize & cleave complementary DNA sequence
  • e.g. CRISPR type II protein Cas9 (Streptococcus pyogenes) CRISPR/Cas9 is now commenly used as a tool for gene editing
  • CRISPR system is directed against DNA 

Q:
Use of the CRISPR/Cas9-system for gene editing
A:
  • A simplified version of of CRISPR/Cas9 has been established by fusing the crRNA & tracrRNA into a syn- thetic guide RNA (gRNA)
  • allows cutting the genome at a desired location
  • can be used to introduce mutations or to insert foreign DNA
  • can create gene knockouts
Q:
small interfering RNAs (siRNAs)
A:
  • Primarily used by plants, worms & insects as a defense mechanism, against RNA viruses
  • less important for mammals because of their specialized immune systems
  • can silence mRNA: Cleavage of double-stranded RNA by Dicer to form siRNA duplex -> Binding to RITS/argonaute complex instead to RISC -> Binding to target RNA -> Transcriptional repression, e.g. by histone methylation
Q:
Homologous recombination repair system for double strand breaks 
A:
  • Strand invasion from broken strand into intact duplex through complementary base pairing -> via repair polymerase
  • release of the invading strand and reforming of double helices 
  • strand invasion id catalysed by RecA/Rad51 proteins
  • HR can lead to loss of heterozygosity if the break is accidentally repaired by using the homologous chromosomes -> critical for cancer formation
  • HR must be tightly regulated
Gentechnik II

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